本期小編為大家分享一篇于2021年1月發(fā)表于Journal of Nuclear Medicine上的文章，題目為“PET Imaging of Tumor PD-L1 Expression with a Highly Specific Nonblocking Single-Domain Antibody”(DOI:10.2967/JNUMED.119.226712)。在這篇文章中，作者研發(fā)了一種靶向PD-L1的單域抗體探針——68Ga-NOTA-Nb109，用于探測(cè)體內(nèi)PD-L1的表達(dá)水平，以輔助PD-1/PD-L1免疫治療。本文通訊作者是江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所的呂高超教授。

研究背景

免疫檢查點(diǎn)分子程序性死亡受體1(PD-1)具有重要的免疫抑制功能，當(dāng)與其配體PD-L1結(jié)合后，通過(guò)傳遞抑制信號(hào)，從而阻止人體免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷。因此，如果能阻斷PD-1/PD-L1信號(hào)，就能夠重新激活免疫系統(tǒng)。目前針對(duì)PD-1/PD-L1信號(hào)通路的治療性抗體已在臨床腫瘤患者的免疫治療中取得了巨大成功。然而，并不是所有腫瘤患者都對(duì)該治療有響應(yīng)，研究表明其預(yù)后與PD-1/PD-L1的體內(nèi)表達(dá)有關(guān)。因此精準(zhǔn)檢測(cè)PD-1/PD-L1的表達(dá)，可以用來(lái)篩選最有可能對(duì)PD-1/PD-L1免疫治療作出反應(yīng)的患者。

使用放射性核素標(biāo)記的抗PD-L1抗體的PET成像可以從整體上直觀且無(wú)創(chuàng)性地監(jiān)測(cè)及評(píng)估腫瘤PD-1/PD-L1表達(dá)水平。然而完整的抗體由于分子量較大，在體內(nèi)代謝較慢，需要較長(zhǎng)時(shí)間才能獲得清晰的顯像結(jié)果。與完整抗體相比，單域抗體分子量小，具有良好的物理化學(xué)特性，在PD-L1靶向顯像劑中具有巨大潛力。同時(shí)，抗體示蹤劑應(yīng)與PD-L1的治療性抗體具有不同的結(jié)合位點(diǎn)，以不受治療過(guò)程中的治療性抗體影響。

設(shè)計(jì)思路

作者首先篩選制備出了一種與PD-L1具有高度親和力的非阻斷型單域抗體，即Nb109，再用螯合劑NOTA對(duì)其進(jìn)行修飾，最后用核素68Ga進(jìn)行標(biāo)記，得到探針68Ga-NOTA-Nb109，并檢測(cè)其產(chǎn)率及穩(wěn)定性。隨后選擇PD-L1表達(dá)陽(yáng)性的A375-hPD-L1細(xì)胞和PD-L1表達(dá)陰性的MCF-7細(xì)胞進(jìn)行體外細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)，制備荷瘤鼠模型，進(jìn)行PET顯像和生物分布研究，驗(yàn)證探針在體內(nèi)外的靶向特異性，探索其在腫瘤免疫治療中的應(yīng)用價(jià)值。

數(shù)據(jù)分析

作者首先驗(yàn)證Nb109對(duì)PD-L1的高度親和力和非阻斷性的特點(diǎn)。用表面等離子共振檢測(cè)Nb109對(duì)人PD-L1蛋白的親和力，計(jì)算得到Nb109和PD-L1之間具有極低的解離平衡常數(shù)和高結(jié)合率常數(shù)(圖1. A)。使用ELISA進(jìn)行競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合測(cè)定，在PD-1存在的情況下，Nb109和PD-L1的結(jié)合曲線之間呈經(jīng)典的S型(圖1. B)，說(shuō)明PD-1不影響Nb109和PD-L1的結(jié)合。

圖1. A：表面等離子共振檢測(cè)Nb109與PD-L1解離常數(shù);B：Nb109與PD-L1的ELISA結(jié)合曲線。

設(shè)計(jì)成像探針，用螯合劑NOTA修飾Nb109后標(biāo)記68Ga，經(jīng)過(guò)Radio-HPLC檢測(cè)，68Ga-NOTA-Nb109放射化學(xué)產(chǎn)率大于95%，放化純度大于98%。該示蹤劑的體外穩(wěn)定性和免疫反應(yīng)性良好(圖2)，保證了后續(xù)的體內(nèi)成像研究。并且68Ga-NOTA-Nb109和Nb109與PD-L1的結(jié)合曲線的相似，這表明NOTA 與68GaCl3的螯合沒(méi)有影響 Nb109對(duì)PD-L1的親和力。

圖2. 68Ga-NOTA-Nb109的高效液相色譜表征。

體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，A375-hPD-L1細(xì)胞對(duì)68Ga-NOTA-Nb109的攝取隨孵育時(shí)間的增加而延長(zhǎng)，2小時(shí)攝取率為6.3%±0.31%，顯著高于陰性對(duì)照組MCF-7細(xì)胞的攝取率(1.3% ±0.44%) ，表明 68Ga-NOTA-Nb109 在腫瘤細(xì)胞中對(duì) PD-L1 的特異性(圖3)。為進(jìn)一步驗(yàn)證Nb109的非阻斷性，作者使用了目前獲批作為治療性抗體的KN035，提前30分鐘將過(guò)量(1000倍)的KN035再加入放射性標(biāo)記物進(jìn)行孵育，檢測(cè)結(jié)果與未處理組相當(dāng)，表明Nb109與PD-L1的結(jié)合不受治療性抗體影響(圖4)。

圖3. 不同時(shí)間點(diǎn)A375-hPD-L1和 MCF-7細(xì)胞系中68Ga-NOTA-Nb109的細(xì)胞攝取。

圖4. 用未標(biāo)記Nb109或KN035預(yù)處理與未預(yù)處理A375hPD-L1細(xì)胞系中68Ga-NOTA-Nb109攝取情況。

后續(xù)進(jìn)行體內(nèi)PET顯像，作者將腫瘤細(xì)胞接種至裸鼠皮下，制成荷瘤鼠模型。經(jīng)尾靜脈注射68Ga-NOTA-Nb109后，進(jìn)行2小時(shí)的動(dòng)態(tài)影像記錄。顯像結(jié)果顯示，荷瘤小鼠A375-hPD-L1細(xì)胞在注射10分鐘后即出現(xiàn)高度的腫瘤攝取，該探針能準(zhǔn)確地描繪病灶。而MCF-7細(xì)胞在任何時(shí)刻都不可見(jiàn)，用KN035預(yù)處理的小鼠在68Ga-NOTA-Nb109的攝取上與未預(yù)處理組相當(dāng)(圖5)。結(jié)果與體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相印證。

圖5. 68Ga-NOTA-Nb109在PD-L1陽(yáng)性(A375-Hpd-L1)及陰性(MCF-7)表達(dá)的腫瘤鼠體內(nèi)PET顯像。

為進(jìn)一步展示68Ga-NOTA-Nb109對(duì)PD-L1的靶向能力，并排出個(gè)體差異影響，將A375-hPD-L1，A375-hPD-L1/A375(1/1, v/v)，A375分別注入到同一只小鼠的不同肢體，并進(jìn)行靜態(tài)的PET顯像。結(jié)果如預(yù)期，A375-hPD-L1腫瘤表現(xiàn)出最高的攝取，A375-hPD-L1/A375混合物在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的放射性攝取都為A375-hPD-L1的一半，而A375腫瘤未見(jiàn)明顯攝取(圖6. A, B)。這一結(jié)果與免疫組化顯示的PD-L1表達(dá)情況密切吻合(圖6. C)。

圖6. 68Ga-NOTA-Nb109在A375-hPD-L1, A375-hPD-L1/A375(1/1, v/v), A375腫瘤鼠體內(nèi)PET顯像。

生物分布顯示該探針有低骨骼和肌肉攝取和高腎臟攝取(圖7)，表明68Ga-NOTA-Nb109的組織非特異性攝取較低，本底干擾較低，具有良好的腫瘤靶向性。藥代動(dòng)力學(xué)顯示探針能快速?gòu)难褐星宄?圖8)，可減少正常組織不必要的輻射時(shí)間。

圖7. 68Ga-NOTA-Nb109的生物分布分析。

圖8. 68Ga-NOTA-Nb109的藥代動(dòng)力學(xué)。

總結(jié)與展望

本文介紹了一種新的免疫PET探針，68Ga-NOTA-Nb109，用于體內(nèi)PD-L1的PET成像，其能快速清晰顯像，并能從血液中快速清除，具有高度的腫瘤/背景比，在腫瘤的PD1/PD-L1檢查點(diǎn)阻斷治療方面有巨大的潛力。作者正在進(jìn)一步探索該探針對(duì)體內(nèi)腫瘤PD-L1水平變化動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)的可行性，以更好地指導(dǎo)優(yōu)化腫瘤治療方案。