今天為大家?guī)硪黄l(fā)表在Food Chemistry上的文章，Unravelingproteome changes of irradiated goat meat and its relationship to off-flavoranalyzed by high-throughput proteomics analysis，文章的一作兼通訊作者是陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院的魏佳。

輻照是一種延長羊肉保質(zhì)期的保鮮技術(shù)，以Co-60等放射性同位素作為輻射源產(chǎn)生γ射線于目標(biāo)物質(zhì)上，達到殺菌效果。然而，輻射可以通過破壞氫鍵和二硫鍵來破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，而羊肉中的不飽和脂肪酸和肌紅蛋白含量很高，容易受到輻照產(chǎn)生的自由基攻擊，從而影響羊肉的食用品質(zhì)，并產(chǎn)生異味。作為肉的重要屬性之一，風(fēng)味也用于評估肉的質(zhì)量，消費者通常將異味與不衛(wèi)生和陳舊聯(lián)系在一起，從而影響到購買欲。

為了評估輻照對羊肉的影響，這篇文章采用高通量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)考察了輻照羊肉的蛋白質(zhì)組的譜圖變化情況和產(chǎn)生異味的原因。通過蛋白質(zhì)組學(xué)方法，作者團隊總共確定了207種豐度發(fā)生顯著變化的蛋白質(zhì)。統(tǒng)計分析結(jié)果表明，不同輻照劑量的樣品之間存在顯著差異。文章還研究了關(guān)鍵蛋白與異味之間的關(guān)系，并鑒定出羊肉的輻射異味是由二十六個蛋白質(zhì)引起，這些蛋白質(zhì)主要參與半胱氨酸和甲硫氨酸的代謝以及蛋白質(zhì)的氧化過程。此外，輻照產(chǎn)生的異味會在羊肉儲存期間的代謝過程中逐漸消散，于是作者團隊還進行了化學(xué)參數(shù)分析以佐證蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果，進一步解釋了輻照羊肉中蛋白質(zhì)與異味之間的關(guān)系。

在這里我們主要介紹文章中對不同輻照劑量下羊肉蛋白質(zhì)組的變化的探索方法和分析，文中運用了許多軟件分析和統(tǒng)計的方法，可以為蛋白質(zhì)組學(xué)中的數(shù)據(jù)整理提供一些思路參考。關(guān)于蛋白質(zhì)樣品處理，作者團隊先按每次輻照劑量取2g磨碎的羊肉與提取緩沖液混合，置于冰上勻漿，經(jīng)超聲處理和離心，收集上清液。之后，依次經(jīng)過烷基化孵育、離心、過濾膜、胰蛋白酶酶切和除鹽步驟，獲得蛋白質(zhì)樣品，用于UHPLC-Q-Orbitrap檢測。獲得的結(jié)果使用MaxQuant軟件進行分析，蛋白與從UniProtKB網(wǎng)站獲得的羊蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫匹配，并通過蛋白質(zhì)非標(biāo)記定量技術(shù)進行定量。

如圖1 A所示，顯示了五種輻照劑量的羊肉樣品的蛋白質(zhì)分布。在五個輻照過的羊肉樣品中一共鑒定出289種共有蛋白。此外，繪制了火山圖以篩選出倍數(shù)變化較大的蛋白質(zhì)以進行進一步研究。對于羊肉樣品中鑒定出的蛋白質(zhì)，進行了PCA分析以區(qū)分五個照射樣品組。隨后在實驗數(shù)據(jù)上進行了ANOVA和PLS-DA以鑒定五種輻照劑量下可以用于區(qū)分羊肉的重要蛋白質(zhì)。

圖1.在五個輻照劑量(0 kGy，1 kGy，2 kGy，4 kGy和6 kGy)下的羊肉樣品的截面圖和統(tǒng)計分析。(A)不同輻照羊肉的蛋白質(zhì)的變化曲線，條上的數(shù)字表示共有的蛋白質(zhì)。(B)不同輻照劑量下羊肉的PCA評分圖。(C)在不同輻照劑量下(R2= 0.999和Q2= 0.997)羊肉的PLS-DA得分圖。

根據(jù)上述算法，PCA的得分圖(圖1 B)顯示，84.7%的可變性是因為兩個主成分分別占異變總數(shù)的45.4%和39.3%。可以看到，來自不同輻照劑量的羊肉樣品組可以被鑒定出的蛋白質(zhì)完全分離并分布在不同的位置，這表明蛋白質(zhì)譜分析存在顯著性差異。基于LFQ強度數(shù)據(jù)的方差分析結(jié)果表明，在5種被輻照的羊肉中，227種常見檢測蛋白質(zhì)的豐度存在統(tǒng)計學(xué)差異(P <0.05)。可以推測，這是由于不同劑量的蛋白質(zhì)不同程度的放射分解引起的。此外，這些重要蛋白滿足文獻統(tǒng)計分析的要求，即使用ANOVA比較差異豐度，顯著性水平P<0.05。隨后用PLS-DA以確定分離的關(guān)鍵蛋白。PLS-DA的得分圖所示(圖1 C)，五個被輻照樣品之間存在明顯區(qū)別(R2 =0.999和Q2=0.997)。交叉驗證后，在已建立的PLS-DA模型中，五個調(diào)查的輻照羊肉樣品顯示100%的差異。在PLS-DA模型中，計算相應(yīng)的VIP分?jǐn)?shù)以評估所研究蛋白質(zhì)的性能。最后，通過同時考慮倍數(shù)變化>2或<0.5，P<0.05和VIP得分>1，突出顯示差異豐富的蛋白質(zhì)(總共207個)。

接下來進行更嚴(yán)格的測試，對篩選出的蛋白質(zhì)進行了不同生物學(xué)數(shù)據(jù)集的無監(jiān)督分層聚類，以評估其合理性和準(zhǔn)確性，并比較這些差異表達蛋白質(zhì)的動態(tài)變化。對五個輻照樣品組中顯著不同的蛋白質(zhì)進行了聚類分析，最終結(jié)果顯示在熱圖中(圖2)提供了可視的數(shù)據(jù)信息。盡管在每個樣品組的六個生物學(xué)重復(fù)樣品中顯示了相似的顏色布局，但以不同劑量(0、1、2、4和6 kGy)照射的樣品表現(xiàn)出不同的顏色分布。對不同輻照樣品組的聚類分析顯示，M1(1 kGy)和M6(6 kGy)首先聚集為一個簇，然后是M0(0 kGy)，M2(2 kGy)和M4(4 kGy)是最遙遠(yuǎn)的群體。總體而言，PCA和熱圖的統(tǒng)計分析結(jié)果高度一致，表明輻照處理后差異表達的蛋白質(zhì)能夠區(qū)分羊肉樣品，可以用公式證明樣品分類的結(jié)果。蛋白質(zhì)氧化的結(jié)果表明，羊肉的蛋白質(zhì)在不同劑量下發(fā)生了顯著變化。據(jù)報道，經(jīng)輻照的火雞產(chǎn)品中的蛋白質(zhì)變化是劑量依賴性的，與目前的分析高度吻合。這可能是受不同劑量輻照的羊肉樣品之間差異顯著的主要原因。

圖2. 輻照羊肉中差異豐富的蛋白質(zhì)的熱圖

這項研究為輻照羊肉的異味產(chǎn)生提供了蛋白質(zhì)組學(xué)的觀點，與生物信息學(xué)分析相結(jié)合，對不同輻照劑量下羊肉蛋白質(zhì)的變化情況進行研究。而對于蛋白質(zhì)的詳細(xì)信息以及輻照劑量與異味代謝的具體關(guān)系等，仍需要投入進一步的工作來確定。