利用64Cu/ 67Cu進(jìn)行預(yù)靶向放射免疫治療的治療診斷方法

摘要: 在過去的十年中，一體化診療已成為腫瘤學(xué)中一種強(qiáng)大的臨床工具，用于篩選對靶向治療有反應(yīng)的患者并監(jiān)測此類患者對治療的反應(yīng)。這篇文章報(bào)告了一種基于銅放射性同位素的預(yù)靶向放射免疫療法(PRIT)的治療診斷方法：發(fā)射正電子的銅-64(Cu-64, t1/2 = 12.7 h)和發(fā)射 β 粒子的銅-67(Cu-67，t1/2= 61.8 h)。該策略基于反式環(huán)辛烯(TCO)偶聯(lián)抗體和四嗪(Tz)放射性配體之間通過快速生物正交逆電子需求Diels-Alder反應(yīng)進(jìn)行的體內(nèi)連接。縱向治療研究在人類結(jié)腸直腸癌的鼠模型中進(jìn)行，使用TCO修飾的huA33抗體(huA33-TCO)和67Cu標(biāo)記的Tz 放射性配體([67Cu]Cu-MeCOSar-Tz)的免疫偶聯(lián)反應(yīng)。在注射huA33-TCO 72h后注射[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz，設(shè)置18.5、37.0或 55.5 MBq的注射劑量，并產(chǎn)生了依賴性治療反應(yīng)，中位生存時(shí)間從最低劑量的68天增加到最高劑量的>200天。此外，以分級方式(二次注射)接受最高劑量 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz的小鼠在不影響治療效果的前提下，改善了血液的輻射副作用。單次施用huA33-TCO后分別注射[64Cu]Cu-MeCOSar-Tz 和[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz的雙放射性核素實(shí)驗(yàn)表明，前者產(chǎn)生的正電子發(fā)射斷層掃描圖像準(zhǔn)確預(yù)測后者的功效。在這些實(shí)驗(yàn)中，觀察到[64Cu]Cu-MeCOSar-Tz]的腫瘤攝取之間和隨后對 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz 的治療反應(yīng)存在相關(guān)性。

前言

基于反式環(huán)辛烯(TCO)和四嗪(Tz)之間的快速和生物正交逆電子需求Diels-Alder點(diǎn)擊反應(yīng)的體內(nèi)預(yù)靶向方法如下所示。該方法包括四個(gè)步驟：1)施用單克隆抗體(mAb)-TCO免疫偶聯(lián)物;2)抗體在腫瘤處積聚并從血液中清除;3) 注射小分子Tz基放射性配體;4)兩個(gè)組分之間的體內(nèi)點(diǎn)擊連接，然后快速清除任何多余的放射性配體。

材料和方法(概述)

MeCOSar-Tz 的合成

MeCOSar-NHS、芐氨基四嗪鹽酸鹽和二異丙基乙胺在1ml二甲基甲酰胺中進(jìn)行，60℃避光下攪拌反應(yīng)1h。產(chǎn)物MeCOSar-Tz通過反相高效液相色譜 (HPLC)純化。HPLC-電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)分析產(chǎn)物餾分，凍干得到粉紅色粉末。

MeCOSar-Tz 的放射性標(biāo)記

使用乙酸銨緩沖液稀釋0.05M HCl中的[64Cu]CuCl2儲(chǔ)存液和0.01 M HCl的[67Cu]CuCl2的儲(chǔ)備液。添加MeCOSar-Tz，將標(biāo)記溶液在攪拌溫度混合器上以500 × g在37°C下孵育20分鐘。通過即時(shí)薄層色譜(iTLC)評估放射性標(biāo)記反應(yīng)，其顯示放射化學(xué)純度> 99%。因此不需要進(jìn)一步純化。

腫瘤模型

所有體內(nèi)研究均在雌性無胸腺裸鼠中進(jìn)行。小鼠在右側(cè)皮下進(jìn)行異種移植，5 × 10^6的SW1222 細(xì)胞懸浮在150 µL 溶液中(1:1 的基質(zhì)膠和細(xì)胞培養(yǎng)基)。腫瘤在~14天后達(dá)到理想的實(shí)驗(yàn)尺寸(~100 mm)。

體外生物分布實(shí)驗(yàn)

對于預(yù)靶向生物分布實(shí)驗(yàn)，在靜脈內(nèi)施用 [ 67 Cu]Cu-MeCOSar-Tz(9.5 至 11.0 MBq，0.7 至 0.8 nmol)前24或72h，通過側(cè)尾靜脈向小鼠注射 huA33-TCO(100 µg、0.7 nmol、5 TCO/mAb)。相比之下，對照組小鼠僅接受 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz(9.3 至 10.0 MBq，0.7 nmol)。在注射 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz后4、24、48和 72 h處死小鼠，收集它們的器官并稱重，使用校準(zhǔn)67 Cu的伽馬計(jì)數(shù)器測定放射性。

在直接放射性標(biāo)記的 huA33 的生物分布實(shí)驗(yàn)中，[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz-TCO-huA33(1.9 MBq, 100 µg, 0.7 nmol)通過尾靜脈注射給藥。在注射后 4、24、72 和120 h，處死小鼠，收集它們的器官并稱重，使用校準(zhǔn)67 Cu的伽馬計(jì)數(shù)器測定放射性。

劑量學(xué)計(jì)算

將每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的五個(gè)組織樣本的平均活性濃度擬合到雙指數(shù)函數(shù)以創(chuàng)建時(shí)間-活性曲線(TAC)。對于大多數(shù)組織，最佳TAC擬合使用一室或二室模型。腫瘤在實(shí)驗(yàn)過程中表現(xiàn)出顯著的吸收，因此，梯形模型一直使用到最后一個(gè)時(shí)間點(diǎn)，之后假設(shè)放射性清除完全由放射性衰變決定。從時(shí)間-活動(dòng)曲線下的面積計(jì)算每個(gè)組織中的累積攝取。

縱向放射治療研究

在縱向放射治療研究中，使用了三個(gè)對照隊(duì)列、四個(gè) PRIT 隊(duì)列、一個(gè)治療診斷 PRIT 隊(duì)列和一個(gè)傳統(tǒng) RIT 隊(duì)列(n = 10)。第一個(gè)對照組僅接受生理鹽水，第二組僅接受 huA33-TCO(100 µg，0.7 nmol，5 TCO/mAb)，第三組僅接受 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz(55.5 MBq，0.7 nmol)。注射日被指定為實(shí)驗(yàn)的“第0天”。

根據(jù)huA33-TCO和[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz預(yù)靶向的生物分布數(shù)據(jù)，選擇72h注射間隔進(jìn)行縱向治療研究，因?yàn)樗谘褐挟a(chǎn)生較低的活性濃度。PRIT隊(duì)列中的所有動(dòng)物都接受了huA33-TCO(100 µg，0.7 nmol，5 TCO/mAb)，72 h后注射了[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz(18.5、37、55.5 或 27.8 MBq)，0.7 nmol，第 0 天)。為了探索分次給藥的功效，接受 27.8 MBq 的組在 48 h后給予第二劑27.8 MBq (0.7 nmol)。在注射后4、24、48 和 96 h進(jìn)行SPECT成像。

在治療診斷 PRIT 隊(duì)列中，在72 h時(shí)間點(diǎn)給小鼠施用 [64Cu]Cu-MeCOSar-Tz(10.4至11.3 MBq，0.7 nmol，第 0 天)，然后在24 h后施用[67Cu]Cu- MeCOSar-Tz (55.5 MBq, 0.7 nmol)。在注射 [ 64Cu]Cu-MeCOSar-Tz后 4、24 和 48 h進(jìn)行 PET 成像。使用64Cu標(biāo)記的放射性配體給藥后48 h采集的PET圖像斷層確定每個(gè)腫瘤內(nèi)的活性，然后與腫瘤生長速率進(jìn)行比較。在 [ 67Cu]Cu-MeCOSar-Tz注射后 4、24、48 和96 h進(jìn)行SPECT成像。在RIT隊(duì)列中，小鼠被給予[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz-TCO-huA33(18.5 MBq，100 µg，0.7 nmol，第0天)，并在注射后 4、24、48和96 h進(jìn)行SPECT成像。

使用Peira TM900設(shè)備每周兩次監(jiān)測異種移植物的體積。在整個(gè)研究過程中，每兩周評估一次所有小鼠的毒性跡象，包括嗜睡、食欲不振和體重下降。定義了五個(gè)可能的研究終點(diǎn)：1)如果腫瘤的最長尺寸達(dá)到 1 厘米;2)如果腫瘤開始阻礙小鼠的運(yùn)動(dòng);3)腫瘤是否壞死;4)如果小鼠體重減輕超過 10%;或5)200 天后。每周從側(cè)尾靜脈收集血樣，并用 HemaVet 950(Drew Scientific)進(jìn)行分析。測量了20個(gè)血液學(xué)參數(shù)，包括白細(xì)胞計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)。

統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均報(bào)告為平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差。使用GraphPad Prism 7.0 軟件進(jìn)行顯著性分析。未配對的雙尾t檢驗(yàn)、多重t檢驗(yàn)或?qū)?shù)秩 Mantel-Cox 檢驗(yàn)被采用。

結(jié)果

生物共軛、合成和放射化學(xué)

huA33-TCO 根據(jù)公布的程序通過帶有NHS的 TCO 變體與親本抗體的反應(yīng)合成，最終產(chǎn)生具有 5.2 ± 0.1 TCO/mAb 標(biāo)記度和免疫反應(yīng)性的免疫偶聯(lián)物88.9 ± 1.8%。進(jìn)行尺寸排阻-HPLC 以驗(yàn)證 huA33-TCO 的純度，并確認(rèn)在生物偶聯(lián)過程中沒有發(fā)生明顯的聚集。對于放射性配體，我們將 Tz 與 MeCOSar 配對，分離的收率約為 38%。[64Cu]Cu-MeCOSar-Tz 放射化學(xué)純度 > 99%，摩爾活性為 15.3 至 16.5 GBq/μmol，而[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz放射化學(xué)純度 >99%，摩爾活性為 74.1 至 82.3 GBq/μmol。在本研究中進(jìn)行的所有體內(nèi)預(yù)靶向?qū)嶒?yàn)中，放射性配體的摩爾活性進(jìn)行了調(diào)整，以確保每次注射含有0.7 nmol的Tz，可以顯示出更好的體內(nèi)結(jié)果。最后，合成了[67Cu]Cu-MeCOSar-huA33，為生物分布和縱向治療實(shí)驗(yàn)提供直接放射性標(biāo)記的抗體對照。[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz 與huA33-TCO在37 °C下反應(yīng)0.5 h。

體外生物分布

首先確定PRIT與 huA33-TCO和[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz單獨(dú)結(jié)合的療效。這個(gè)過程開始于預(yù)靶向生物分布實(shí)驗(yàn)，旨在探索[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz，確定注射免疫偶聯(lián)物和放射性配體的最佳間隔時(shí)間，便于計(jì)算對腫瘤和健康器官的輻射劑量率。為此，給帶有scA33抗原表達(dá)SW1222人結(jié)腸直腸癌異種移植物的無胸腺裸鼠施用huA33-TCO，然后在24或72 h的間隔后施用[67Cu]Cu-MeCOSar -Tz。此外，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)的對照組，其中荷瘤小鼠單獨(dú)施用相同劑量的[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz。在 4、24、48 和72 h后，處死并收獲腫瘤以及選定的器官，清洗，干燥，并在伽馬計(jì)數(shù)器上測定)。

在沒有 huA33-TCO 的情況下，[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz迅速從血液和健康器官中清除，通過尿液排出，產(chǎn)生的腫瘤攝取可忽略不計(jì)(即72 h時(shí)為0.2 ± 0.1% ID/g注射后 [hpi])。相反，在用 huA33-TCO和 [67 Cu] Cu-MeCOSar-Tz處理的小鼠中觀察到腫瘤中的高活性濃度，在 72 h時(shí)的值達(dá)到 10.2 ± 2.1%ID/g(24 h間隔)和 9.2 ± 1.3%ID/g(72 h間隔) 在這些相同的小鼠中，殘留活性濃度在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中，血液中的攝取量下降，從4 h時(shí)的3至4%-ID/g開始，到120 hpi時(shí)達(dá)到0.5至1.0% ID/g。在整個(gè)研究過程中，其他組織的攝取量保持相對較低，肝臟是攝取量最高的健康器官(~1至3% ID/g)。總之，這些數(shù)字產(chǎn)生了高腫瘤與健康器官活動(dòng)濃度比，例如，注射間隔為72 h的隊(duì)列在120 hpi時(shí)，腫瘤與血液、肌肉、肝臟和大腸的比率分別為 20.2 ± 7.7、159.2 ± 35.6、6.0 ± 1.6和66.8 ± 37.7。

劑量學(xué)

從生物分布數(shù)據(jù)計(jì)算兩個(gè)預(yù)靶向間隔的輻射劑量率和治療指數(shù)。此外，使用直接標(biāo)記的 [67Cu]Cu-huA33 進(jìn)行了生物分布實(shí)驗(yàn)，并用于劑量學(xué)計(jì)算。正如預(yù)期的那樣，與直接放射性標(biāo)記的抗體相比，兩種預(yù)靶向方法都降低了輻射劑量率。例如，間隔 72 h的預(yù)靶向策略對血液和肝臟產(chǎn)生的劑量率分別為5.9和14.2 cGy/MBq，而[67Cu]Cu-huA33 對相同器官產(chǎn)生72.3和111.5 cGy/MBq 的劑量率。然而，與接受直接標(biāo)記抗體的隊(duì)列(574.5 cGy/MBq )表示所有三種方法的治療指數(shù)(腫瘤的輻射劑量率與對特定健康組織的輻射劑量率之比)處于相似的范圍內(nèi)。也就是說，雖然以 24 h間隔進(jìn)行預(yù)靶向產(chǎn)生的腫瘤對血液治療指數(shù)低于直接標(biāo)記的抗體，但以 72 h間隔的預(yù)靶向策略產(chǎn)生最高治療指數(shù)。最后，鑒于其較高的腫瘤對血液治療指數(shù)，選擇72h PRIT策略進(jìn)行縱向治療研究。

縱向放射治療

進(jìn)行了縱向放射治療研究以詢問這種PRIT方法的有效性和安全性。這些實(shí)驗(yàn)最初使用了八組攜帶sc SW1222人類結(jié)腸直腸癌小鼠。三個(gè) PRIT 隊(duì)列接受 huA33-TCO(100 μg，0.7 nmol)，72 h后接受三種不同劑量的 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz：18.5、37.0或55.5 MBq(每種情況下，0.7 nmol)。相比之下，三個(gè)對照組僅接受載體(0.9% 無菌鹽水)、單獨(dú)的 huA33-TCO 或單獨(dú)的[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz (55.5 MBq)。為了探究分次給藥的價(jià)值，第七組接受了 huA33-TCO(100 μg，0.7 nmol)，然后在72 h后接受了兩次 27.8 MBq劑量的[67Cu]Cu-MeCOSar-Tz，間隔48h。最后，第八個(gè)“傳統(tǒng) RIT”隊(duì)列接受了單劑量的 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz-TCO-huA33(18.5 MBq)。

對照組小鼠的腫瘤生長在整個(gè)研究過程中沒有減弱，而PRIT組和RIT組小鼠的腫瘤表現(xiàn)出較短的生長初期，隨后體積急劇減小。放療組中的所有小鼠最終都達(dá)到了異種移植物比第 0 天時(shí)小。在三個(gè)單劑量 PRIT 組中觀察到劑量依賴性治療反應(yīng)，接受了55.5 MBq的 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz表現(xiàn)出最顯著的再生長延遲。在接受18.5 MBq常規(guī)放射免疫的 [ 67 Cu]Cu-huA33的小鼠中發(fā)現(xiàn)了類似的再生延遲。最后，接受分級 PRIT 的小鼠的反應(yīng)在很大程度上反映了 55.5 MBq PRIT 組的反應(yīng)。

使用 Kaplan-Meier 圖可以最清楚地顯示每種治療方案的療效。對照組的中位生存時(shí)間為 21 天(生理鹽水組)、21 天(僅huA33-TCO)和 31.5 天(僅 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz)。這些值與接受治療的隊(duì)列的中位生存時(shí)間形成鮮明對比：68.5 天(單劑量 PRIT，18.5 MBq)、98.5 天(單劑量 PRIT，37.0 MBq)、200 天(單劑量 PRIT， 55.5 MBq)、189 天(分次劑量 PRIT)和 200 天(RIT)。數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析證實(shí)了在對照組和所有放射治療組之間以及在 18.5 和 37.0 MBq PRIT 組和其余三個(gè)實(shí)驗(yàn)組之間存在顯著差異(P值 < 0.01)。然而，在55.5 MBq PRIT、分段 PRIT和傳統(tǒng)RIT隊(duì)列的生存率之間不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。雖然在研究期間殺死的絕大多數(shù)小鼠的腫瘤超過了最大允許大小，但由于其他病理，少數(shù)動(dòng)物不得不被殺死或被發(fā)現(xiàn)死亡。根據(jù)劑量測定數(shù)據(jù)、體重測量和血液分析，這些事件不太可能源于放射內(nèi)治療本身，而是與免疫功能低下的小鼠的衰老有關(guān)。

SPECT 成像

除了具有治療作用的 141 keV β粒子外，67Cu還發(fā)射185 keV(49%) 和93 keV (16%)的伽馬射線，這些伽馬射線適用于SPECT成像。為了探索利用這些射線來可視化Cu-67療法的可能性，在放射性給藥后 4、24、48 和 96 h對每個(gè)隊(duì)列進(jìn)行了SPECT成像。在接受分段劑量 PRIT 的小鼠中，在 48 h SPECT 掃描后給予第二劑 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz，并在4 h(第一次劑量后52 h)和 48 h(第一次給藥后 96 h)再次對小鼠進(jìn)行成像。總而言之，這些圖像說明了幾個(gè)趨勢。第一， [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz 通過泌尿道排泄，在 4 hpi采集的圖像中清晰可見。其次，在所有隊(duì)列中，腫瘤是24 h后活性濃度最高的組織。第三，在第二次給藥后，接受分段 PRIT 的隊(duì)列中的腫瘤活性濃度增加，強(qiáng)調(diào)了這種方法的可行性。最后，正如預(yù)期的那樣，與PRIT組相比，直接標(biāo)記[67Cu]Cu-huA33的組在肝臟中表現(xiàn)出升高的活性濃度。

體重和血液分析

為了評估這種方法的潛在毒性，每周測量每只動(dòng)物的體重兩次。所有的小鼠——除了對照組中只接受 huA33-TCO 的小鼠——在整個(gè)研究過程中都保持了可接受的體重(> 原始體重的 90%)。在前2周內(nèi)，僅55.5 MBq PRIT[ 67Cu]Cu-MeCOSar-Tz、分次劑量PRIT 和RIT組群中觀察到小鼠體重略有下降，但這種趨勢在不久之后便自我糾正。然而，一般而言，任何放射治療組的平均體重減輕不超過5%，這表明這種方法在測試的最高劑量下具有良好的耐受性。

除了監(jiān)測動(dòng)物的體重外，每周對來自每個(gè)隊(duì)列的代表性小鼠的血液進(jìn)行分析。在所有接受67Cu的隊(duì)列中，白細(xì)胞(WBC)計(jì)數(shù)最初都下降了，盡管這些值在實(shí)驗(yàn)過程中恢復(fù)了。在 55.5 MBq 單劑量 PRIT 隊(duì)列中觀察到最大的下降。有趣的是，當(dāng) 55.5 MBq 的 [67Cu]Cu-MeCOSar-Tz作為分次給藥(間隔 2 天的兩次 27.8 MBq 的劑量)時(shí)，WBC 計(jì)數(shù)的下降幅度較小(第 7 天P = 0.01)。毫不奇怪，與接受相同劑量放射性(18.5 MBq)的 PRIT 隊(duì)列相比，RIT 隊(duì)列的 WBC 計(jì)數(shù)下降幅度更大，恢復(fù)也更緩慢。所有接受67 Cu 的隊(duì)列的血小板計(jì)數(shù)同樣下降，但最顯著的下降發(fā)生在 55.5 MBq PRIT 隊(duì)列中。此外，與接受等劑量 PRIT 的組相比，在接受 RIT 的隊(duì)列中再次觀察到血小板計(jì)數(shù)顯著下降(第 14 天P = 0.001)。然而，與WBC 計(jì)數(shù)一樣，降低的血小板計(jì)數(shù)值在研究的前3周在所有隊(duì)列中恢復(fù)。

將治療診斷 PET 成像融入67 Cu-PRIT

研究的最后一步是對 PRIT 的雙同位素方法進(jìn)行體內(nèi)評估，該方法結(jié)合了64 Cu PET 成像和67 Cu 放射治療。為此，進(jìn)行了一項(xiàng)縱向治療實(shí)驗(yàn)，其中給攜帶 sc A33 抗原表達(dá) SW1222 的無胸腺裸鼠注射 3 次：huA33-TCO(100 μg，0.7 nmol)，然后在 72 h后注射 [ 64 Cu]Cu-MeCOSar -Tz(10.4 到 11.3 MBq，0.7 nmol)，24 h后注射[ 67 Cu]Cu-MeCOSar-Tz(55.5 MBq，0.7 nmol)。從治療的角度來看，這種方法產(chǎn)生的平均生存期 > 200 天，腫瘤生長停滯與三種最有效的治療策略相當(dāng)：55.5-MBq PRIT、分割 PRIT 和 RIT。在施用64 Cu 標(biāo)記的放射性配體后 4、24 和 48 h收集的 PET 圖像反映了我們之前的發(fā)現(xiàn)，即腫瘤組織在早期時(shí)間點(diǎn)清晰可見，并且在 24 和 48 h時(shí)成為最突出的特征。毫不奇怪，在 48 h收集的 PET 圖像顯示腫瘤攝取 [ 64 Cu]Cu-MeCOSar-Tz的異質(zhì)性，異種移植物中心的放射性水平范圍為 3.0 至 12.6 kBq。重要的是，個(gè)體小鼠的治療反應(yīng)似乎與腫瘤中[ 64 Cu]Cu-MeCOSar-Tz的攝取水平相關(guān)。也就是說，經(jīng)歷腫瘤再生的四只小鼠是腫瘤中[ 64 Cu]Cu-MeCOSar-Tz攝取量最低的四只小鼠：3.0、4.1、5.6和6.8 kBq。相比之下，腫瘤中[ 64 Cu]Cu-MeCOSar-Tz 水平較高的六只小鼠(均>9.0 kBq)表現(xiàn)出完全的腫瘤緩解。最后，從[ 67 Cu]Cu-MeCOSar-Tz獲得的 SPECT 圖像與 PET 圖像非常相似，增強(qiáng)了后者的治療診斷價(jià)值。

討論

長期以來免疫放射偶聯(lián)一直有望用于內(nèi)照射治療，但對健康組織的高輻射劑量率阻礙了其廣泛臨床使用。近年來，治療診斷成像幫助臨床醫(yī)生選擇 RIT 患者并優(yōu)化放射免疫偶聯(lián)物的劑量，以最大限度地提高其安全性和有效性。而且，雖然顯像劑的出現(xiàn)推動(dòng)了該領(lǐng)域的發(fā)展，但它并沒有消除放射性標(biāo)記抗體的內(nèi)在問題。

這項(xiàng)研究的首要目標(biāo)是創(chuàng)建一種預(yù)靶向的放射內(nèi)治療方法，能夠利用抗體和治療診斷成像的優(yōu)勢，同時(shí)避開全長免疫球蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)及劑量學(xué)的限制。該策略基于攜帶 TCO 的免疫偶聯(lián)物和含有 Tz 的放射性配體之間的快速生物正交逆電子需求 Diels-Alder 連接?；谠摬呗砸言谛∈竽Ｐ椭序?yàn)證了有關(guān)18F, 68Ga, 177Lu, and 225Ac的標(biāo)記和不同的抗體。最近，將該預(yù)靶向策略這些演示中的每一個(gè)都只關(guān)注一種模式：PET 或 PRIT。

當(dāng)我們將注意力轉(zhuǎn)移到預(yù)靶向的治療診斷方法上時(shí)，很明顯，我們需要使用發(fā)射適合成像和治療的單個(gè)放射性核素或一對放射性核素。鑒于前者少之又少，我們轉(zhuǎn)向使用放射性核素對。沿著這些思路，我們證明了使用64 Cu 和177 Lu 標(biāo)記的四嗪進(jìn)行雙同位素預(yù)靶向的可行性：[ 64 Cu]Cu-SarAr-Tz和 [ 177 Lu]Lu-DOTA-PEG 7 -Tz。毫無疑問，這項(xiàng)工作的一個(gè)最重要的發(fā)現(xiàn)是注射第一種放射性配體不會(huì)對第二種放射性配體的腫瘤攝取或整體生物分布產(chǎn)生不利影響。也就是說，在使用 huA33-TCO 和 [ 177 Lu]Lu-DOTA-PEG 7 -Tz 給藥之間的 48 h間隔的預(yù)靶向?qū)嶒?yàn)中，在相同條件下在腫瘤中觀察到在 4、24 和 48 h活性濃度為 5.2 ± 1.2、9.0 ± 2.6 和 13.0 ± 2.8% ID /g，但在免疫偶聯(lián)物后一天和177 Lu 標(biāo)記的放射性配體前一天注射 [ 64 Cu]Cu-SarAr-Tz和 [ 177 Lu]Lu-DOTA-PEG7-Tz的腫瘤活性濃度幾乎相同：在相同時(shí)間點(diǎn)為4.9 ± 0.4、11.3 ± 1.6 和 13.1 ± 2.7% ID/g。這種現(xiàn)象在治療診斷學(xué)的背景下至關(guān)重要，因?yàn)樗_保用于成像的放射性配體不會(huì)減弱用于治療的放射性配體的攝取或功效。然而，從治療診斷的角度來看，這種基于64 Cu/ 177 Lu的策略最終不是最理想的，因?yàn)檫@兩種放射性配體是不同的，因此會(huì)表現(xiàn)出不同的藥代動(dòng)力學(xué)特征和體內(nèi)行為。此外，使用177 Lu( t 1/2∼ 6.7 d) 未能利用體內(nèi)預(yù)靶向的一個(gè)重要方面：使用具有通常與抗體不相容的半衰期的放射性核素的能力。

在這項(xiàng)工作中，針對這些問題，我們使用了銅的兩種放射性同位素——發(fā)射正電子的64 Cu 和發(fā)射 β 粒子的67 Cu——來產(chǎn)生一對化學(xué)上相同的放射性配體：[ 64 Cu]Cu-MeCOSar-Tz和[ 67 Cu]Cu-MeCOSar-Tz。使用作為同位素體的放射性配體有兩個(gè)主要優(yōu)點(diǎn)。首先，兩種放射性配體的體內(nèi)行為將相同，便于使用前者作為后者生物分布的預(yù)測因子。其次，僅使用一種化學(xué)物質(zhì)作為放射性配體(Cu-MeCOSar-Tz)將簡化毒理學(xué)測試并簡化整個(gè)監(jiān)管審查過程。

使用 huA33-TCO 和 [ 67 Cu]Cu-MeCOSar-Tz 進(jìn)行預(yù)靶向的生物分布數(shù)據(jù)呈現(xiàn)出相對較少的驚喜。放射性配體的腫瘤攝取甚至在最早的時(shí)間點(diǎn)就很明顯，并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中都在增長，這表明67 Cu 標(biāo)記的四嗪正在與腫瘤結(jié)合的 huA33-TCO 和隨后在異種移植物中積累的循環(huán)免疫偶聯(lián)物發(fā)生反應(yīng)。[ 67 Cu]Cu-MeCOSar-Tz相對較快地從血液和健康器官中清除，最終全面產(chǎn)生有希望的腫瘤與健康器官活性濃度比。從劑量學(xué)的角度來看，與直接放射性標(biāo)記的67 Cu-huA33相比，64Cu-PRIT 策略可顯著降低個(gè)體器官劑量率。67Cu-PRIT 與177Lu 標(biāo)記的 huA33進(jìn)行比較時(shí)，也可以看到輻射劑量的減少。這可以說是更現(xiàn)實(shí)的比較，因?yàn)?7 Cu 很少用于標(biāo)記臨床的全長 IgG。也就是說， 67 Cu-PRIT對血液的輻射劑量率估計(jì)為5.9 cGy/MBq，而67 Cu-huA33為 71.3 cGy/MBq， 177 Lu-huA33為 67.7 cGy/MBq。然而，與直接標(biāo)記的67 Cu-huA33 和177 Lu-huA33相比， 67 Cu-PRIT對腫瘤產(chǎn)生的輻射劑量也較低。因此，大多數(shù)器官的預(yù)靶向治療指數(shù)通常與傳統(tǒng)放射免疫偶聯(lián)物的治療指數(shù)相當(dāng)，而67 Cu-PRIT 的關(guān)鍵腫瘤-血液治療指數(shù)(9.7，間隔 72 h)僅略高一些，高于67 Cu-huA33(8.1)，但仍低于177Lu A33(18.6)。這是未來可以改進(jìn)的領(lǐng)域。例如，優(yōu)化方法的時(shí)間安排和每種成分的劑量可以通過增加對腫瘤的劑量率和/或降低對健康器官的劑量率來改善治療指數(shù)。此外，我們的實(shí)驗(yàn)室和其他人還探索了使用清除劑作為降低血液和健康器官中活動(dòng)濃度的一種手段;然而，清除劑雖然有效，但不可避免地會(huì)給已經(jīng)很復(fù)雜的系統(tǒng)增加另一個(gè)復(fù)雜因素。

縱向治療研究提供了一個(gè)平臺(tái)來比較各種治療策略的療效。最重要的是，與所有對照組相比，所有放療組在平均生存時(shí)間方面都表現(xiàn)出統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異。此外，在低、中和高劑量PRIT隊(duì)列中觀察到具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的劑量依賴性反應(yīng)。有趣的是，雖然在 55.5 MBq PRIT(200 天)和分級 PRIT(189 天)組的中位生存時(shí)間之間沒有觀察到統(tǒng)計(jì)學(xué)上的顯著差異，但后者的四只小鼠在實(shí)驗(yàn)過程中腫瘤再生，而前者僅有一個(gè)。這一現(xiàn)象可能是由于分級劑量隊(duì)列直到給藥后120小時(shí)才接受第二次27.8 MBq劑量(使總劑量達(dá)到55.5 MBq)，這可能降低了腫瘤的總輻射劑量。盡管如此，分級 PRIT 隊(duì)列的 SPECT 成像結(jié)果清楚地表明，放射配體的第二次給藥增加了腫瘤中的活性濃度，這表明如果進(jìn)一步優(yōu)化，分級給藥可能是一種可行的方法。55.5 MBq PRIT 隊(duì)列的平均生存時(shí)間也與接受 18.5 MBq [67 Cu]Cu-huA33相匹配。 然而，RIT 隊(duì)列的表現(xiàn)確實(shí)優(yōu)于接受相同 18.5 MBq 劑量的 PRIT 隊(duì)列，鑒于 RIT 對腫瘤組織的劑量率較高，這一結(jié)果并不令人驚訝。值得注意的是，RIT 和 PRIT 在 37.0和 55.5 MBq 水平上沒有進(jìn)行等劑量比較，因?yàn)槲墨I(xiàn)表明這些劑量的67Cu標(biāo)記抗體會(huì)在小鼠中引起急性輻射毒性。最后，體重監(jiān)測和血液分析通常表明所有放射治療策略都具有良好的耐受性，盡管在接受較高輻射劑量的小鼠隊(duì)列中觀察到體重、WBC 計(jì)數(shù)和血小板計(jì)數(shù)輕微但暫時(shí)的下降。

盡管67Cu-PRIT本身就具有前景，但該研究最令人興奮的結(jié)果可能來自于采用我們的PRIT治療方法的實(shí)驗(yàn)。在縱向治療研究中，接受治療診斷64/67 Cu-PRIT 的隊(duì)列的平均存活時(shí)間 > 200 天，與接受 55.5-MBq PRIT 和 18.5-MBq RIT 治療的組相同。也就是說，與接受相同劑量 [ 67 Cu]Cu-MeCOSar-的單劑量 PRIT 組中僅一只腫瘤再生相比，治療診斷 PRIT 組中的四只小鼠表現(xiàn)出腫瘤再生。根據(jù)我們之前的發(fā)現(xiàn)，一種放射性配體的給藥不會(huì)阻礙第二種放射性配體的吸收，這種現(xiàn)象不太可能與治療診斷隊(duì)列中使用兩次注射有關(guān)。一個(gè)更可能的解釋可能在于腫瘤的異質(zhì)性，或者更有可能的是，單劑量 PRIT 隊(duì)列中的小鼠在注射 huA33-TCO 后 72 h接受了 [ 67 Cu]Cu-MeCOSar-Tz 而那些在治療組收到67免疫偶聯(lián)物給藥后 96 h銅標(biāo)記的放射性配體。然而，最關(guān)鍵的發(fā)現(xiàn)是，PET 成像結(jié)果可以讓我們預(yù)測哪些小鼠會(huì)經(jīng)歷腫瘤再生。在 48 h PET 掃描(3.0、4.1、5.6 和 6.8 kBq)中，腫瘤中放射性水平最低的四只小鼠是腫瘤再生的小鼠。相比之下，該隊(duì)列中的所有其他成員——其異種移植物含有 > 9.0 kBq 的 [ 64 Cu]Cu-MeCOSar-Tz——都經(jīng)歷了腫瘤組織的完全和持久的收縮。最后，雖然我們之前的工作確定了雙放射性核素預(yù)靶向的可行性，但這項(xiàng)研究進(jìn)一步推進(jìn)了兩個(gè)關(guān)鍵步驟：證明了67Cu-PRIT 并說明了預(yù)靶向64 Cu-PET 作為對67 Cu-PRIT 響應(yīng)的預(yù)測指標(biāo)的有用性。

這項(xiàng)調(diào)查的數(shù)據(jù)為將治療診斷 PET 成像納入 PRIT 方案制定了清晰的路線圖。隨著預(yù)靶向 PET 越來越接近臨床——預(yù)計(jì) 2021 年初來自胰腺癌患者的第一張圖像——人們可以很容易地想象未來如何將預(yù)靶向成像和治療結(jié)合起來：在收集初始 PET 掃描后，醫(yī)生可以決定患者是否適合 PRIT。如果腫瘤標(biāo)準(zhǔn)攝取值 (SUV) 高于預(yù)定閾值，則患者將接受一劑治療性 Tz 放射性配體。另一方面，如果 PET 掃描顯示攝取不足，臨床醫(yī)生將轉(zhuǎn)向并尋求其他治療選擇。