藥物的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)研究是新化學(xué)分子實(shí)體開(kāi)發(fā)過(guò)程中最重要的研究?jī)?nèi)容之一，也是藥物注冊(cè)過(guò)程中不可缺少的關(guān)鍵部分。相對(duì)于常規(guī)生物樣本檢測(cè)技術(shù)，放射性標(biāo)記示蹤技術(shù)優(yōu)勢(shì)明顯，例如生物體對(duì)標(biāo)記與非標(biāo)記的藥物分子不做區(qū)分，兩者所表現(xiàn)的生物學(xué)特征是一致的，同時(shí)，放射性核素通過(guò)衰變釋放可被檢測(cè)的射線(xiàn)信號(hào)進(jìn)行物質(zhì)定量和定位，可以避免生物基質(zhì)的干擾。在CFDA發(fā)布的《藥物非臨床藥代動(dòng)力學(xué)研究技術(shù)指導(dǎo)原則》中也指出了放射性同位素示蹤技術(shù)在藥動(dòng)學(xué)研究過(guò)程中的應(yīng)用價(jià)值和優(yōu)勢(shì)。隨著放射性標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展，在藥物發(fā)現(xiàn)和開(kāi)發(fā)階段中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛。本文對(duì)近年來(lái)放射性同位素在藥物研發(fā)中的應(yīng)用進(jìn)行了梳理和總結(jié)，特別是該技術(shù)在體外、體內(nèi)動(dòng)力學(xué)和藥物安全性評(píng)價(jià)領(lǐng)域中的價(jià)值和優(yōu)勢(shì)，以及放射性標(biāo)記檢測(cè)新技術(shù)的應(yīng)用，以期為藥物研發(fā)企業(yè)、相關(guān)領(lǐng)域研究人員提供新的可借鑒的參考。
1 放射性同位素示蹤劑的選擇
在放射性標(biāo)記示蹤中，除了放化純度和比活度外，選擇合適的放射性核素和標(biāo)記位置至關(guān)重要。常用的核素有14C、3H、125I、32P、35S等，其中14C和3H是藥動(dòng)學(xué)研究中最常用的放射性核素，其特點(diǎn)首先是它發(fā)出的是很安全的低能β射線(xiàn)，易于防護(hù)并可用液閃技術(shù)測(cè)得，實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果檢測(cè)十分方便，特別是14C;其次由于其半衰期長(zhǎng)(5 730年)，在實(shí)驗(yàn)中測(cè)得的數(shù)據(jù)結(jié)果計(jì)算時(shí)不需要作物理半衰期的矯正。14C主要應(yīng)用于小分子藥物的示蹤研究，在標(biāo)記位點(diǎn)的選擇時(shí)，一般應(yīng)首先考慮對(duì)分子結(jié)構(gòu)中的芳香環(huán)或脂環(huán)上的C原子進(jìn)行標(biāo)記，而盡可能避免在羧基、羥基、巰基、氨基等活性部位進(jìn)行標(biāo)記，還應(yīng)遠(yuǎn)離化學(xué)鍵斷裂位置，因?yàn)橐坏┻@些不穩(wěn)定基團(tuán)脫離母體化合物，就失去了對(duì)母體藥物及主要代謝物的示蹤能力。目前在小分子化藥的放射性同位素應(yīng)用實(shí)例中，14C超過(guò)80%。
3H特點(diǎn)與14C有些相似(發(fā)射低能β射線(xiàn)，半衰期12.35年)，與14C比其缺點(diǎn)是標(biāo)記物容易與環(huán)境中的1H原子發(fā)生交換，因此穩(wěn)定性較差。3H的優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記物的合成較為方便廉價(jià)，因此在標(biāo)記物能夠滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)需求的情況下，也常選用3H標(biāo)記物作為示蹤劑。此外，3H不僅能用于小分子藥物ADME研究，還可以用于某些大分子藥物(如多糖)的示蹤劑。
另外主要用于蛋白/多肽類(lèi)藥物研究的核素是125I，它可以用化學(xué)合成法共價(jià)結(jié)合到酪氨酸或組氨酸的側(cè)鏈上。125I發(fā)射γ射線(xiàn)，可以用γ計(jì)數(shù)儀檢測(cè)，由于γ射線(xiàn)穿透性較強(qiáng)，樣品檢測(cè)幾乎不受基質(zhì)效應(yīng)影響。另外125I半衰期較短(59.6 d)，放射性廢物存放一定時(shí)間后，待放射活度降低至環(huán)境本底水平，即可按普通廢物進(jìn)行處理，相較于其他核素來(lái)說(shuō)對(duì)環(huán)保的負(fù)面影響較少。
常規(guī)實(shí)驗(yàn)多采用一種放射性同位素標(biāo)記待測(cè)的藥物，但有時(shí)原型藥物在代謝過(guò)程中因化學(xué)鍵斷裂同時(shí)生成2個(gè)重要代謝產(chǎn)物，這時(shí)可采取雙標(biāo)記技術(shù)的放射性示蹤劑，此時(shí)最好選用不同能量或發(fā)射不同類(lèi)型射線(xiàn)的核素，例如14C/3H、14C/125I等。
2 放射性同位素示蹤技術(shù)在體外研究中的應(yīng)用
2.1 在體外腸吸收試驗(yàn)中的應(yīng)用
藥物在胃腸道的吸收性可通過(guò)藥物透過(guò)胃腸道的滲透能力評(píng)價(jià)，此外腸壁細(xì)胞內(nèi)側(cè)存在藥物外排泵，可以把已經(jīng)攝入細(xì)胞內(nèi)的藥物外排出去，從而影響藥物的吸收與藥物的生物利用度。人類(lèi)結(jié)腸腺癌Caco-2 細(xì)胞系，具有與小腸上皮細(xì)胞相似的形態(tài)和功能，在透性支持物上培養(yǎng)可完成自動(dòng)分化，形成具微絨毛以及緊密連接等類(lèi)似于小腸上皮細(xì)胞刷狀緣側(cè)的分化特征的單細(xì)胞層。目前，該細(xì)胞模型結(jié)合放射性同位素示蹤技術(shù)已廣泛用于評(píng)價(jià)藥物腸道滲透能力、預(yù)測(cè)藥物口服吸收利用度及預(yù)測(cè)藥物與外排轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的親和力等。
放射性探針?biāo)幬锶?4C-聚乙二醇4000、14C-甘露醇、3H-普萘洛爾等可用于細(xì)胞完整性和致密性研究，常作為Caco-2系統(tǒng)的模型藥物在各種文獻(xiàn)中提到，并被FDA推薦應(yīng)用。3H-地高辛為推薦的外排型藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-gp的標(biāo)準(zhǔn)底物，可以作為探針?biāo)幬镉糜贑aco-2細(xì)胞中P-gp的活力驗(yàn)證。總結(jié)文獻(xiàn)報(bào)道及國(guó)內(nèi)外指導(dǎo)原則，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室研究經(jīng)歷，本文對(duì)Caco-2細(xì)胞模型常用的放射性工具藥及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)做出了歸納，可供研究者參考，見(jiàn)表1.因同位素探針?biāo)幬锏臏y(cè)定相較于質(zhì)譜測(cè)定操作簡(jiǎn)易，耗時(shí)短，檢測(cè)限低，在用Caco-2細(xì)胞進(jìn)行人體生物等效性豁免試驗(yàn)時(shí)經(jīng)常將其作為不同BCS分類(lèi)的工具藥使用。3H-普萘洛爾、3H-美托洛爾、3H-米諾地爾、3H-肌酐、14C-二甲雙胍、14C-甘露醇等目前在本實(shí)驗(yàn)室作為不同滲透性工具藥用于人體生物等效性豁免試驗(yàn)。
2.2 在基于藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的體外研究中的應(yīng)用
從藥物研發(fā)和臨床的觀(guān)點(diǎn)，藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白研究的重要性是集有效性和安全性于一身。藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白不僅直接參與藥物的吸收、分布、排泄等藥動(dòng)學(xué)行為，同時(shí)與分布于靶器官的有效藥物濃度密切相關(guān)，直接影響藥效的發(fā)揮、藥物的體內(nèi)清除和毒副作用的產(chǎn)生。因此，建立有效的藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白體外篩選評(píng)價(jià)體系，提高對(duì)臨床前研發(fā)藥物的有效性和安全性評(píng)價(jià)，是加速新藥研發(fā)的有效方法。
本研究室通過(guò)基因克隆、基因重組、載體構(gòu)建、細(xì)胞轉(zhuǎn)染等技術(shù)，構(gòu)建了20余人源轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，以放射性同位素標(biāo)記的不同轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的特異性底物為探針，用液體閃爍計(jì)數(shù)儀進(jìn)行測(cè)定，進(jìn)行藥物與不同藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的親和性研究。現(xiàn)將本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建好的人源藥物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系及所用的放射性同位素總結(jié)于表3.供研究者參考。在細(xì)胞模型試驗(yàn)中，同位素標(biāo)記化合物的應(yīng)用是最常見(jiàn)的，包括3H和14C兩種標(biāo)記方式。14C標(biāo)記化合物半衰期長(zhǎng)，且結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，但3H的檢測(cè)靈敏度能達(dá)到14C的1 000倍左右，因此在選擇放射性標(biāo)記種類(lèi)時(shí)，既要考慮標(biāo)記化合物的穩(wěn)定性，還要考慮與轉(zhuǎn)運(yùn)體的親和性和檢測(cè)靈敏度。
2.3 在體外酶代謝中的應(yīng)用
在藥物發(fā)現(xiàn)和早期開(kāi)發(fā)階段，還沒(méi)進(jìn)行人體試驗(yàn)，體外代謝實(shí)驗(yàn)將提供可能在人體內(nèi)觀(guān)察到的代謝模式的早期信息，而放射性同位素示蹤技術(shù)在體外酶代謝中更是起著無(wú)可替代的作用。通常用肝組分(微粒體或S9)或肝細(xì)胞獲得體外代謝物譜。體外代謝物譜的經(jīng)典做法是，將一種藥物與肝微粒體等孵化，然后通過(guò)放射性檢測(cè)和LC/MS/MS對(duì)孵化液進(jìn)行色譜分析，以追蹤和鑒定代謝物。放射性標(biāo)記藥物作為示蹤劑還可以方便地比較藥物在不同種屬的代謝情況。體外反應(yīng)表型實(shí)驗(yàn)中，常應(yīng)用質(zhì)譜法比較代謝產(chǎn)物和原藥的離子化程度等評(píng)估代謝產(chǎn)物的相對(duì)生成量，但一旦獲得放射性標(biāo)記藥物，可以應(yīng)用HPLC-放射性檢測(cè)法，通過(guò)比較特征放射性峰測(cè)定體外代謝表型研究中代謝產(chǎn)物的相對(duì)豐度，然后用特定酶在微粒體等的相對(duì)豐度對(duì)重組酶的反應(yīng)速率進(jìn)行換算。
2.4 在血漿蛋白結(jié)合率和血細(xì)胞分配率研究中的應(yīng)用
血漿蛋白結(jié)合在測(cè)定藥物總的代謝分布中發(fā)揮著非常重要的作用。血漿中非結(jié)合的藥物很容易到達(dá)靶器官，反之結(jié)合到血漿蛋白上的藥物則很難通過(guò)毛細(xì)管壁以及穿透細(xì)胞膜。藥物進(jìn)入血管外空間的能力也由藥物在血液成分(如紅細(xì)胞)中的分配特性決定。紅細(xì)胞分離和血漿蛋白結(jié)合度通常可以通過(guò)體外研究評(píng)估。測(cè)定血漿蛋白結(jié)合最可靠的方法是檢測(cè)平衡透析試驗(yàn)中血漿及緩沖液內(nèi)游離藥物的含量。液質(zhì)聯(lián)用方法比較耗時(shí)，涉及到方法建立、方法確證和樣品制備等問(wèn)題，且還存在基質(zhì)干擾問(wèn)題(因血漿蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)含有高鹽濃度的樣品溶液中會(huì)產(chǎn)生離子抑制等問(wèn)題)。相反，若采用放射性標(biāo)記化合物研究蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)，則可以通過(guò)液體閃爍計(jì)數(shù)儀直接測(cè)定藥物濃度。而且因其獨(dú)特的檢測(cè)特性，放射性檢測(cè)也能夠獲得更加準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。
3 放射性同位素標(biāo)記在藥物體內(nèi)動(dòng)力學(xué)研究中的應(yīng)用
藥物的吸收、分布、代謝和排泄是藥物開(kāi)發(fā)階段研究中重要的組成部分，通過(guò)獲得的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，可以很好地闡明藥物在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律。在生物藥劑學(xué)評(píng)價(jià)中，藥代參數(shù)可以用于評(píng)價(jià)制劑的特性和質(zhì)量。而在藥效學(xué)和毒理學(xué)評(píng)價(jià)中，藥代行為可以為揭示藥物的作用機(jī)制，選擇適宜的動(dòng)物種屬提供參考，特別是藥物及其相關(guān)代謝產(chǎn)物的體內(nèi)濃度也與其藥效/毒效高度相關(guān)。因此獲取藥物動(dòng)力學(xué)數(shù)據(jù)對(duì)于藥品開(kāi)發(fā)評(píng)價(jià)就顯得尤為重要。
諾和諾德公司通過(guò)3H和14C標(biāo)記針對(duì)其開(kāi)發(fā)的新型長(zhǎng)效凝血因子IX產(chǎn)品(nonacogbeta pegol, N9-GP)進(jìn)行了完整的動(dòng)力學(xué)特征評(píng)價(jià)。吸收動(dòng)力學(xué)、組織分布、排泄數(shù)據(jù)通過(guò)單次靜脈注射給予雄性Wistar大鼠和犬標(biāo)記藥物后采集樣本測(cè)定獲得。研究結(jié)果顯示原型藥物具有某種程度的兩相分布特征，血漿消除較快(半衰期1～2 d)，而總放射性檢測(cè)則顯示出明顯的兩相特征，初始分布1～2周(t1/2α：2～3 d)而后表現(xiàn)出較長(zhǎng)的末端消除過(guò)程(t1/2β:15～18 d)，長(zhǎng)半衰期也與其他PEG化的蛋白末端消除的行為一致。通過(guò)放射性表型分析發(fā)現(xiàn)血漿中兩種主要的放射性標(biāo)記物分別是完整的N9-GP和40 kDa左右的PEG，給藥后1周左右，血漿中的主要成分是N9-GP，而隨著N9-GP的降解消除，游離的PEG的含量上升并且長(zhǎng)期存留于血液循環(huán)中。另外，組織分布研究指出N9-GP的放射性多集中于肝和腎臟，結(jié)果與排泄研究一致，大約有44%和28%的總放射性(3H)，56%和49%的總放射性(14C)分別經(jīng)尿和糞便回收。其中最強(qiáng)的放射性回收集中于給藥后的24 h，并且約有一半的放射性在給藥后2～3周回收。N9-GP的肝腎分布和排泄也通過(guò)放射自顯影研究得到了進(jìn)一步的確證。
Lee等通過(guò)對(duì)PEG化的血紅素SB1進(jìn)行125I標(biāo)記示蹤研究其藥動(dòng)學(xué)行為。在分別靜脈給予雄性SD大鼠(5、12.5 mL/kg)和beagle犬(10 mL/kg)放射標(biāo)記的血紅素SB1后，利用伽馬計(jì)數(shù)器檢測(cè)全血和血漿中的放射信號(hào)。大鼠低劑量組給藥后血漿Cmax、t1/2、AUC和Tmax分別為9.055 mg/mL、9.6 h、79.6 mg/(h?mL)和0.2 h，全血中Cmax、t1/2、AUC和Tmax則分別為4.954 mg/mL、9.7 h、37.6 mg/(h?mL)和0.11 h。而高劑量組給藥后Cmax和Tmax呈現(xiàn)明顯劑量相關(guān)性，分別增加2.1和2.8倍。給予beagle犬后，血紅素t1/2顯著增加約5倍，顯示出慢消除的特點(diǎn)。相關(guān)研究為評(píng)估PEG化血紅素藥理特征提供了數(shù)據(jù)支持。
除應(yīng)用放射性標(biāo)記進(jìn)行臨床前藥物動(dòng)力學(xué)研究外，人體試驗(yàn)中放射性標(biāo)記也十分重要，GSK開(kāi)發(fā)了一種口服MEK1/2選擇性抑制劑曲美替尼并在I期臨床研究中通過(guò)微量示蹤(microtracer)研究了藥物在人體內(nèi)的暴露，特別是其生物利用度。先口服給予受試者2 mg未標(biāo)記的曲美替尼后，再經(jīng)靜脈注射給予5 μg(約7.4 kBq，200 nCi)14C標(biāo)記的藥物。結(jié)果顯示曲美替尼的絕對(duì)生物利用度約72.3%，同時(shí)其血漿清除率約為3.21L/h。較高的生物利用度和較低的清除率也表明藥物的肝臟提取率較低，首關(guān)效應(yīng)不明顯。另外，藥物經(jīng)口服和靜脈給藥的消除半衰期為10～11 d。對(duì)于這種長(zhǎng)半衰期的藥物，放射微量示蹤技術(shù)就體現(xiàn)出了明顯優(yōu)勢(shì)，例如可以避免傳統(tǒng)交叉試驗(yàn)中的較長(zhǎng)的清洗期，因此可以讓受試者無(wú)需等待就可以接受其他藥物治療或者招募正在清洗期的病人進(jìn)入新的試驗(yàn)研究。
4 放射性同位素示蹤技術(shù)在物質(zhì)平衡、代謝機(jī)制中的應(yīng)用
在藥物臨床前開(kāi)發(fā)和早期臨床研究階段，通過(guò)收集動(dòng)物或受試者的排泄物(包括糞、尿和膽汁)可以進(jìn)行物質(zhì)平衡研究，進(jìn)而獲取受試藥物的排泄途徑和排泄速率，以及進(jìn)行代謝產(chǎn)物鑒定和藥物吸收行為估計(jì)。在物質(zhì)平衡研究和代謝機(jī)制研究方面，放射性同位素標(biāo)記結(jié)合傳統(tǒng)LC-MS法已經(jīng)顯示出了明顯優(yōu)勢(shì)。
基因泰克公司在研究曲妥珠單抗-Emtansin偶聯(lián)物組成中的微管抑制劑DM1的代謝過(guò)程中通過(guò)靜脈單次給藥給予了SD大鼠3H標(biāo)記的DM1。研究指出放射性從血液中快速消除，并分布在主要器官。給藥5 d后，近乎100%的總放射性通過(guò)糞便進(jìn)行了回收，其中膽汁排泄占據(jù)了藥物主要的排泄途徑(3d回收了46%)，而尿液排泄不足5%。另外除膽汁樣本分析提示原型藥物占比較小外，DM1的代謝產(chǎn)物主要通過(guò)氧化、水解、S-甲基化和結(jié)合反應(yīng)生成。結(jié)果表明DM1在體消除快速，并且藥物代謝途徑廣泛，同時(shí)主要通過(guò)肝膽途徑排除體外。
Richter O等在近期針對(duì)一種口服MEK1/2高選擇性抑制劑Pimasertib進(jìn)行了完整的人體藥動(dòng)學(xué)研究時(shí)使用了放射性同位素標(biāo)記。受試者分別接受靜脈推注2 μg(約9 kBq)和口服60 mg(約2.6 MBq)14C標(biāo)記的Pimasertib。研究結(jié)果表明口服給藥后85.1%的總放射性可以在排泄物中回收，其中藥物主要通過(guò)尿(52.8%)和糞便(30.7%)排泄，另外78.9%的放射性是以代謝產(chǎn)物的形式存在，并且找到了兩種血漿中主要的代謝產(chǎn)物。
由于放射性同位素更高的靈敏度，通過(guò)給予動(dòng)物或者受試者放射性標(biāo)記的物質(zhì)后采集排泄物樣本可以獲得比傳統(tǒng)生物檢測(cè)方法更好的物質(zhì)平衡研究結(jié)果，結(jié)合藥動(dòng)學(xué)結(jié)果可以更好地對(duì)原型藥物和代謝產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和定量分析。盡管通常條件下，放射性標(biāo)記技術(shù)可以達(dá)到總放射性回收率85%甚至更高，但是低回收率情況也時(shí)有出現(xiàn)，例如樣本收集不完全，特別是對(duì)于大動(dòng)物(beagle犬、猴)難以完全收集其排泄物，同時(shí)籠具清洗困難;另外放射標(biāo)記位置選擇也會(huì)決定放射性回收，那些可以斷裂進(jìn)入內(nèi)源性代謝途徑的位點(diǎn)可以導(dǎo)致標(biāo)記部位最終代謝為14CO2而從呼吸道排出，因此在選擇動(dòng)物種屬和標(biāo)記位點(diǎn)是應(yīng)全面考慮，盡可能避免造成低回收的情形出現(xiàn)。
5 放射性同位素示蹤技術(shù)在藥物安全性評(píng)價(jià)中的應(yīng)用
藥物及其代謝產(chǎn)物需要在開(kāi)發(fā)階段進(jìn)行動(dòng)物和人體實(shí)驗(yàn)研究其暴露程度以確保藥物相關(guān)物質(zhì)的安全性。在ICH非臨床安全性評(píng)價(jià)研究指南《NonclinicalSafety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and MarketingAuthorization for Pharmaceuticals》中對(duì)于超過(guò)10%總暴露量的代謝產(chǎn)物要求進(jìn)行評(píng)估，而以非放射性標(biāo)記方法測(cè)定所有代謝產(chǎn)物的暴露量通常是不可靠的，特別是對(duì)于那些有很多代謝產(chǎn)物的藥物，而單劑量給予放射性標(biāo)記的藥物則可以很好解決這些問(wèn)題。
以利希普坦(Lixivaptan)為例，Prakash C等利用口服單次給予受試者14C標(biāo)記的利希普坦后采樣進(jìn)行血漿中代謝產(chǎn)物的表征和定量分析，與臨床前毒理研究中所得代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)代謝產(chǎn)物的差異。對(duì)于廣泛代謝的利希普坦，pyrrolocarboxylic(M5)和anthranilicacid(M6)被鑒定是利希普坦的主要代謝產(chǎn)物，其中anthranilic acid在人體、大鼠和犬上都被證實(shí)是主要代謝產(chǎn)物，而pyrrolocarboxylicacid在大鼠和犬上暴露則相對(duì)低得多。另一個(gè)吡咯烷酮代謝產(chǎn)物M3在大鼠和犬上被確證為主要代謝產(chǎn)物，而在人體試驗(yàn)中M3難以與另外2個(gè)代謝產(chǎn)物M1和M2進(jìn)行區(qū)分，M3的作用因此難以在人體上確證。除了主要代謝產(chǎn)物外，研究還找到了另外6個(gè)代謝產(chǎn)物，其中M6、7、8的暴露量均高于大鼠或犬上的含量，而M1、2、3的暴露相較于動(dòng)物則低得多。另外還有其他未能指認(rèn)的成分，但是總暴露量低于5%，因此與藥物的安全性相關(guān)性較弱，可不做過(guò)多關(guān)注。盡管在人體上唯一暴露的代謝產(chǎn)物情況比較罕見(jiàn)，更多的情況還是藥物的代謝產(chǎn)物表型種屬差異小，而暴露量存在明顯差別，因此FDA指南建議在早期藥物開(kāi)發(fā)階段進(jìn)行藥物代謝差異分析。另外啟動(dòng)大規(guī)模臨床研究前需要明確藥物代謝產(chǎn)物的類(lèi)型和種屬差異，因此盡可能早的進(jìn)行代謝產(chǎn)物表征和確證就顯得十分迫切。
6 放射性標(biāo)記檢測(cè)新技術(shù)
在放射性同位素檢測(cè)應(yīng)用中，液體閃爍分析(liquid scintillation counting, LSC)、流動(dòng)液體閃爍分析(flow scintillation analyzer, FSA)和微孔液體閃爍分析(microplatescintillation counting, MSC)通常作為在線(xiàn)或離線(xiàn)檢測(cè)器與傳統(tǒng)分析方法聯(lián)用進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析、結(jié)構(gòu)確證和定量分析。而正電子發(fā)射斷層成像技術(shù)(positron emissiontomography, PET)包括PET/CT和PET/MRI作為一種高靈敏的非侵入式成像技術(shù)正在被大量應(yīng)用于藥物開(kāi)發(fā)的臨床和非臨床研究階段。PET通過(guò)給予受試者或者動(dòng)物11C、13N、15O、18F等缺中子同位素，基于這些元素衰變同時(shí)釋放正電子的特性，并結(jié)合湮滅反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生光子強(qiáng)度不同的特點(diǎn)通過(guò)計(jì)算機(jī)處理放大進(jìn)行影像重建，進(jìn)而從分子水平反映組織器官病理生理、生化代謝、功能性改變或體內(nèi)受體分布。PET技術(shù)除了在疾病早期篩查和診斷外(如病灶定位)，PET也可以對(duì)于藥物的在體過(guò)程進(jìn)行精確定位。例如將18F標(biāo)記的脫氧葡萄糖(FDG)給予受試者后通過(guò)其分布進(jìn)行癌癥篩查，通常健康的甲狀腺中FDG含量很低，而異常高水平的FDG可根據(jù)其攝取方式作為慢性甲狀腺炎或腫瘤惡性程度的判定指標(biāo)。另一個(gè)PET技術(shù)的成功應(yīng)用則是利用11C標(biāo)記的維拉帕米研究環(huán)孢霉素對(duì)P-gp底物攝取的抑制作用。作為血腦屏障中最重要的外排型轉(zhuǎn)運(yùn)體，P-gp控制著很多藥物包括抗腫瘤藥物的外排過(guò)程。但是由于難以檢測(cè)，因此在體研究P-gp抑制劑的作用極為困難。Muzi等通過(guò)給予健康受試者15O標(biāo)記的水分子進(jìn)行血流評(píng)估，之后注射11C標(biāo)記的維拉帕米進(jìn)行P-gp功能評(píng)估。通過(guò)比對(duì)是否給予環(huán)孢素A的條件下11C標(biāo)記的維拉帕米的動(dòng)態(tài)影像數(shù)據(jù)定量，發(fā)現(xiàn)環(huán)孢素A對(duì)于P-gp的抑制可顯著提高腦組織中維拉帕米的含量約73%，因此通過(guò)這種非侵入方式可以方便地對(duì)P-gp介導(dǎo)的藥物腦組織中的暴露影響，特別是其抑制劑進(jìn)行研究。盡管PET技術(shù)靈敏、分辨率高，但是相對(duì)于其他穩(wěn)定同位素，PET所用同位素半衰期一般較短，11C和18F的半衰期分別只有約20min和2 h，這為制備放射標(biāo)記的化合物提出了相當(dāng)高的要求，同時(shí)組織分布研究也只能在較短的時(shí)間里完成。當(dāng)然較短的半衰期也減少了在體研究過(guò)程中對(duì)放射劑量調(diào)整的 要求。
除PET技術(shù)外，另一種近些年來(lái)被廣泛應(yīng)用的放射性同位素檢測(cè)技術(shù)是加速器質(zhì)譜技術(shù)(accelerator mass spectrometry, AMS)。作為傳統(tǒng)放射性檢測(cè)技術(shù)的補(bǔ)充和替代方法，加速器質(zhì)譜現(xiàn)在多與液相或液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行生物樣本的定量分析。AMS通過(guò)測(cè)量樣本中碳同位素的比例(14C/12C)進(jìn)而對(duì)含14C標(biāo)記的待測(cè)物進(jìn)行定量。與依賴(lài)同位素衰變的傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)相比，AMS極大地提高了檢測(cè)的靈敏度，相較于液閃檢測(cè)可提高至約3千萬(wàn)倍。隨著檢測(cè)靈敏度的提高，含14C標(biāo)記的化合物的給藥劑量也可以隨之大幅下降。除此之外，AMS檢測(cè)物質(zhì)單一、不受化合物結(jié)構(gòu)和基質(zhì)效應(yīng)的影響，也很好地彌補(bǔ)了傳統(tǒng)LC-MS檢測(cè)技術(shù)的不足。
基于技術(shù)發(fā)展，AMS現(xiàn)如今已經(jīng)被大量應(yīng)用于藥物研究，特別是藥動(dòng)學(xué)領(lǐng)域中。微劑量給藥(通常也指0期臨床研究)可以通過(guò)給予人體常規(guī)治療劑量的1%甚至更低的水平來(lái)獲得藥物的動(dòng)力學(xué)參數(shù)，例如吸收動(dòng)力學(xué)、組織分布、代謝和排泄。由于給藥劑量有限，監(jiān)管機(jī)構(gòu)對(duì)此也準(zhǔn)許免于在研新藥申請(qǐng)即可進(jìn)行有限人體實(shí)驗(yàn)用以采集相關(guān)數(shù)據(jù)。盡管微劑量給藥與常規(guī)劑量給藥后藥物在體過(guò)程并不完全一致，但是微劑量給藥研究所得PK數(shù)據(jù)與常規(guī)劑量給藥所得結(jié)果相關(guān)性整體上依然高達(dá)80%以上。另外在代謝產(chǎn)物安全性研究方面，AMS的優(yōu)勢(shì)也十分明顯。通過(guò)給予受試者混有一定比例14C標(biāo)記的藥物(通常約10 kBq)后檢測(cè)血漿中總放射性與原型藥物含量進(jìn)行比較，可以直接判斷代謝產(chǎn)物的水平并決定是否后續(xù)進(jìn)行代謝產(chǎn)物分析。通過(guò)LC-AMS聯(lián)用可以直接對(duì)原型藥物及其相關(guān)代謝產(chǎn)物暴露水平進(jìn)行定量分析，并與臨床前研究所獲得數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)來(lái)確證主要代謝產(chǎn)物是否有差別。
7 放射性同位素示蹤技術(shù)應(yīng)用前景
現(xiàn)如今，放射性同位素標(biāo)記示蹤技術(shù)在藥物開(kāi)發(fā)中，特別是藥動(dòng)學(xué)中已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，與傳統(tǒng)生物檢測(cè)手段互為補(bǔ)充，相得益彰。除了在藥物動(dòng)力學(xué)表征、組織分布、代謝/排泄機(jī)制和物質(zhì)平衡等方面發(fā)揮積極作用外，放射性標(biāo)記還在以下領(lǐng)域顯現(xiàn)出了不可比擬的優(yōu)勢(shì)：(1)非常規(guī)代謝產(chǎn)物鑒定，通過(guò)對(duì)維莫德吉(Vismodegib)進(jìn)行14C標(biāo)記研究代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)了吡啶環(huán)非常規(guī)開(kāi)環(huán)過(guò)程;(2)藥物的蛋白共價(jià)結(jié)合(covalent protein binding,CPB)，藥物分子代謝生成活性中間體并與酶或核酸共價(jià)結(jié)合進(jìn)而導(dǎo)致功能蛋白失活，為此默克公司開(kāi)發(fā)了在體和離體CPB測(cè)試方案來(lái)評(píng)估候選藥物生物激活的可能性;(3)生物等效豁免(BE Waiver)，如果某藥物生物利用度超過(guò)90%或者90%以上藥物經(jīng)由尿液排出，對(duì)于生物藥劑學(xué)III類(lèi)藥物則可以判定為高滲透性。另外，新核素的標(biāo)記應(yīng)用和新標(biāo)記方法，例如雙標(biāo)法研究藥物動(dòng)力學(xué)特征和組織分布也使獲取相關(guān)信息更加方便和準(zhǔn)確。
從監(jiān)管機(jī)構(gòu)和制藥企業(yè)的認(rèn)識(shí)角度盡管已經(jīng)對(duì)應(yīng)用放射性標(biāo)記研究藥物特征達(dá)成共識(shí)，但是在何時(shí)、何種情況下進(jìn)行放射標(biāo)記的ADME研究尚存爭(zhēng)論。通常來(lái)講，利用體外模型進(jìn)行早期代謝評(píng)估可以有效提高開(kāi)發(fā)效率，進(jìn)行跨種屬的代謝表型分析可以為臨床前毒理研究選擇合適動(dòng)物模型提供相應(yīng)依據(jù)。FDA也明確鼓勵(lì)申辦方在藥物開(kāi)發(fā)階段通過(guò)多種手段獲取相關(guān)代謝數(shù)據(jù)，因而，盡早通過(guò)放射標(biāo)記技術(shù)獲取所需數(shù)據(jù)可以加速藥物研發(fā)進(jìn)程，縮短品種上市進(jìn)程。
