據(jù)估計，每年有數(shù)以萬計被診斷為癌癥的女孩和年輕成年婦女面臨著與治療有關(guān)的對她們未來生育、激素生產(chǎn)、心理和性健康的威脅。目前，由于診斷和治療的進(jìn)步，許多兒童和青年癌癥的高長期存活率是可以實現(xiàn)的;然而，很多類型腫瘤與長期的生殖和內(nèi)分泌影響有關(guān)。這些腫瘤，包括肉瘤、室管膜瘤、副神經(jīng)節(jié)瘤、神經(jīng)鞘瘤、軟骨肉瘤和脊索瘤，通常需要對卵巢附近的靶點進(jìn)行放射治療。因此，迫切需要新的放射治療策略來預(yù)防對患有盆腔腫瘤的婦女進(jìn)行放療所帶來的卵巢損害。

近年來，調(diào)強(qiáng)放射治療(IMRT)等先進(jìn)技術(shù)被越來越多地用于減少對周圍健康組織的高劑量照射;然而，這導(dǎo)致低劑量和中劑量的輻射被傳送到更大的區(qū)域。因此，即使使用最先進(jìn)的光子治療方式，卵巢損傷很大程度上也是不可避免的。由于質(zhì)子束獨特的物理學(xué)優(yōu)勢，此前已經(jīng)有人提出使用質(zhì)子治療來預(yù)防卵巢損傷，但質(zhì)子治療在卵巢功能或卵巢儲備方面的安全性從未在人類或動物研究中直接進(jìn)行過測試。因此，對于質(zhì)子SOBP遠(yuǎn)端生物有效性的提高或產(chǎn)生的次級中子是否會對敏感卵巢組織造成意外的損傷，存在很大的不確定性。

日前，來自西北大學(xué)范伯格醫(yī)學(xué)院放射腫瘤科的研究人員以雌性小鼠為研究對象，對小鼠在分別接受γ射線放射治療(GRT)和質(zhì)子放射治療(PRT)后其AMH(anti-Mullerian hormone)及原始卵泡數(shù)量進(jìn)行了比較，并探討了質(zhì)子放射治療保留卵巢功能和保護(hù)卵巢儲備能力的可行性和有效性。原文發(fā)表于紅皮雜志《International Journal of Radiation Oncology · Biology · Physics》。

材料和方法

動物定位及照射條件

研究人員將雌性青春期前CD-1小鼠(出生后21天，n=124)分為：1)對照組(n=30);2)單次劑量1.8 Gy GRT(n=13);3)單次劑量1.8 Gy PRT，卵巢定位在擴(kuò)展布拉格峰(SOBP)坪區(qū)中心(n=13，見圖1A);4)單次劑量1.8 Gy PRT，卵巢定位在SOBP坪區(qū)以外(n=29，見圖1C);5)單次劑量0.2 Gy GRT(n=14);6)單次劑量0.2 Gy PRT，卵巢定位在SOBP坪區(qū)中心(n=13，見圖1A);7)單次劑量0.2 Gy PRT，卵巢定位在SOBP遠(yuǎn)端下降區(qū)(n=12，見圖1B)。圖1描述了質(zhì)子治療中動物卵巢位于SOBP的位置。

研究人員使用標(biāo)定后的筆形束掃描質(zhì)子束對小鼠進(jìn)行了PRT實驗。麻醉后(三溴乙醇250 mg/kg，腹腔注射)，小鼠被放置在一個由水等效蠟制成的定制平臺中。該平臺還包含3個平行板電離室，分別位于相對于平臺頂部1、5和20毫米水等效深度處。室內(nèi)激光被用來將動物的骨盆定位于質(zhì)子束中心軸上。小鼠采用俯臥位，布置射野從下方照射小鼠。在所有PRT實驗中，處方劑量使用恒定的RBE值1.1。

小鼠GRT實驗采用銫-137γ輻照裝置進(jìn)行。麻醉后，小鼠被放置在定制的以鉛為基礎(chǔ)的合金屏蔽室中，在屏蔽室的兩側(cè)開一個直徑為5厘米的圓形切口，讓光束穿透動物的骨盆，同時阻擋射線穿過身體的其他部分。特別是下丘腦-垂體區(qū)域，以排除由于關(guān)閉下丘腦-垂體-性腺的反饋系統(tǒng)而導(dǎo)致卵巢功能停止的可能性。在每只小鼠的頭部、側(cè)面和腹部放置熱釋光量計，在照射后確定其接受的物理劑量。

AMH評價治療后卵巢功能

通過測量AMH來評估卵巢功能隨時間的變化。在基線和治療后1周、3周、8周，對動物進(jìn)行稱重并采用下頜刺針穿刺來獲得干血點(DBS)。在試驗卡上采集DBS，并存儲在零下80度條件下，然后送去處理(An實驗室)。樣品批間和批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.8%和3.0%，AMH的檢出下限為0.012 ng/mL。

用存活的卵巢原始卵泡計數(shù)評估治療后卵巢儲備

通過計算治療后8周的原始卵泡總數(shù)來評估卵巢儲備。最后一次采集DBS后，采集卵巢并使用改良的戴維森固定液在4度條件下將其固定24小時，石蠟塊包埋，并以5微米厚進(jìn)行連續(xù)切片。每組4只動物(8只卵巢)用蘇木精和伊紅染色，每隔5個切片計數(shù)卵泡。采用數(shù)字成像系統(tǒng)采集顯微圖像，并使用ImageJ Version 1.45s進(jìn)行成像分析和卵泡計數(shù)。

體外全卵巢照射，驗證質(zhì)子和光子照射對卵巢原始卵泡儲備的影響

為了驗證PRT在相對于SOBP精確測量的深度對原始卵泡的影響，研究人員進(jìn)行了一個單獨的實驗。采集自出生后5天的雌性小鼠(n=56)的卵巢，在12孔板中加入生長介質(zhì)、原蛋白和ITS，置于便攜式培養(yǎng)箱中，溫度為37℃，二氧化碳濃度為2%。離體小鼠卵巢被放置在一個定制的水等效蠟?zāi)Ｖ?。卵巢組分別被放置在SOBP坪區(qū)的中心，遠(yuǎn)端SOBP區(qū)域外5 cm，遠(yuǎn)端SOBP區(qū)域外0.5 cm，及遠(yuǎn)端SOBP區(qū)域外1 cm。

統(tǒng)計分析

所有的統(tǒng)計分析和繪圖使用R 3.5.3版本。采用方差分析(ANOVA)對數(shù)值變量和類別變量進(jìn)行組間比較。由于在整個研究過程中對單個動物反復(fù)測量了AMH，因此使用隨機(jī)多變量線性混合效應(yīng)回歸來評估放射治療方式、劑量和每個時間點AMH變化之間的關(guān)系?？紤]到基線卵巢儲備和AMH水平的預(yù)期差異，以及動物間不同放射敏感性的潛在差異，這些被認(rèn)為是隨機(jī)效應(yīng)。固定效應(yīng)會考慮放療劑量、動物體重、是否對動物進(jìn)行CT、AMH測量時間(基線、1周、3周、8周)。同時檢測AMH測量時間與劑量組間的相互作用。對于所有的測量，P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

研究結(jié)果

卵巢功能和原始卵泡儲備功能只有在卵巢處在SOBP以外時才能通過質(zhì)子治療得以保存

為了驗證傳輸?shù)膭┝恳约八鼈儗β殉苍悸雅菟劳龅挠绊?，研究人員采用GRT或PRT治療方式對動物進(jìn)行了試驗。當(dāng)動物被定位好后，使用放置在動物背部和腹部表面的熱釋光劑量計來測量劑量。此外，治療后會進(jìn)行CT掃描。在治療后的第1、3和8周，通過AMH的變化來評估卵巢功能?？紤]到動物體重，在卵巢處于SOBP坪區(qū)外時，AMH與對照組相當(dāng)(P=0.5)，表明卵巢功能得以保留。然而，在傳輸1.8 Gy的GRT治療(β=-4.9 ng/mL;P<0.001)或卵巢處于SOBP坪區(qū)中心的PRT治療(β=-5.1 ng/mL;P<0.001)中AMH值大幅度下降，提示卵巢功能衰竭已經(jīng)發(fā)生。

對于卵巢位于SOBP坪區(qū)中心接受0.2 Gy劑量照射的動物，無論是GRT還是PRT治療，均顯示卵巢功能下降。在治療后8周，AMH值顯著低于對照組，這是由于產(chǎn)生AMH的生長濾泡的增殖顆粒細(xì)胞受到損傷的原因。這一結(jié)果說明了即使是在小劑量照射后，AMH在檢測長期卵巢損傷時仍具有一定的敏感性。

縱向測量AMH可預(yù)測放療后卵巢儲備功能

為了評估AMH是否能夠作為卵巢剩余儲備功能的替代標(biāo)志物，在GRT放療后1、3和8周對AMH進(jìn)行了縱向測量，并與動物體重和各類卵泡數(shù)量進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示原始卵泡總數(shù)與AMH顯著相關(guān)。AMH與初級卵泡、次級卵泡及囊狀卵泡也同樣被觀察到具有顯著相關(guān)性。

卵巢位于遠(yuǎn)端SOBP時，質(zhì)子治療后AMH水平保持不變，但原始卵泡儲備減少

當(dāng)卵巢位于SOBP遠(yuǎn)端經(jīng)過0.2 Gy PRT照射后，與對照組相比，治療后8周的AMH值無顯著差異，這表明卵泡顆粒細(xì)胞未見明顯損傷。然而，盡管AMH值正常，但在治療8周后，這些卵巢的原始卵泡總數(shù)顯著降低(平均每只動物原始卵泡410.2個，相對于675.5個;P=0.005)。與對照組相比，如預(yù)期的一樣，產(chǎn)生AMH的卵泡被保存了下來。

體外卵巢照射證實了質(zhì)子照射對體內(nèi)觀察到的原始卵泡儲備功能的影響

與對照組相比，位于SOBP之外的卵巢沒有顯示出顯著的原始卵泡丟失;位于SOBP遠(yuǎn)端的卵巢有顯著的原始卵泡丟失;位于SOBP坪區(qū)中心的卵巢有顯著的原始卵泡丟失。

討論

鑒于許多罹患癌癥的年輕婦女的存活率大大提高，人們也越來越重視生活質(zhì)量，特別是生育和內(nèi)分泌功能。PRT可在支持改善生殖結(jié)果方面發(fā)揮重要作用，可以增強(qiáng)需要對盆腔區(qū)域進(jìn)行放射治療的婦女的生育能力。此外，兒童時期對子宮的照射會導(dǎo)致不可逆轉(zhuǎn)的纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致成年后子宮體積的減小。這種并發(fā)癥與未來的死胎和新生兒死亡有關(guān)。如本研究所示結(jié)果，如果子宮接受PRT治療并置于質(zhì)子SOBP之外，這種并發(fā)癥也可能會被避免。

此外，需要注意的是，小鼠模型可能不適用于人類。事實上，XRT/GRT照射在小鼠卵巢中的一些劑量反應(yīng)關(guān)系可能與人類不同。此外，束流品質(zhì)在不同的擺位條件下會有顯著的差異，僅指定SOBP的使用并不能充分說明束流品質(zhì)，特別是在遠(yuǎn)端邊緣或布拉格峰以外。在本動物研究中，沒有直接評估束流品質(zhì)的影響。研究人員表明需要開展進(jìn)一步的工作，這包括為了評估從小鼠劑量反應(yīng)結(jié)論外推到人類的準(zhǔn)確方法而需要直接測量卵巢附近的束流品質(zhì)。關(guān)于小鼠卵巢劑量敏感性的結(jié)論可能并不能直接適用于人類。然而，通過比較這些研究中的PRT和XRT/GRT照射，可以得出這些不同照射方式對小鼠卵巢功能影響的相關(guān)結(jié)論，并假設(shè)這些相對差異在人類中保持不變。

研究結(jié)論

AMH水平和原始卵泡總數(shù)是卵巢組織學(xué)和功能的敏感指標(biāo)。研究人員表明，利用這些標(biāo)記物，可以通過使用體外和體內(nèi)小鼠模型，來評估XRT/GRT照射卵巢、PRT照射SOBP坪區(qū)中心區(qū)域的卵巢及PRT照射SOBP遠(yuǎn)端區(qū)域的卵巢的輻射損傷效應(yīng)。在該項研究中，研究人員證實了PRT照射位于SOBP以外的卵巢仍可以使小鼠保持卵巢儲備功能，這也證明了質(zhì)子治療在保留生育功能方面的安全性，并提議質(zhì)子放射治療可以作為一種可行的生育保留放療策略。