用18F代替68Ga標記得到的18F-exendin-4性能如何？
已有研究顯示68Ga-exendin-4可與胰高血糖素樣肽-1受體(GLP-1R)發(fā)生特異性結合，對胰島素瘤具有診斷價值。對比68Ga，18F具有產(chǎn)量高、能量低、半衰期適宜等優(yōu)點，基于此，謝運飛等開展了18F-exendin-4的自動化合成研究，并報告了1例臨床病例應用結果。研究結果顯示合成的藥物達標、安全可靠，胰島素瘤患者胰腺體部見結節(jié)狀18F-exendin-4高攝取。
研究背景
胰島素瘤是胰腺最常見的功能性神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(neuroendocrine neoplasm, NEN)，大多為良性[1]。高胰島素血癥性低血糖是其主要的臨床癥狀，同時伴隨震顫、心悸等自主神經(jīng)癥狀，及精神錯亂、行為改變、人格改變、視覺障礙、癲癇發(fā)作和昏迷等意識障礙及精神癥狀[2]。目前，胰島素瘤的病因和發(fā)病機制尚不十分清楚。
胰高血糖素樣肽-1(glucagon-like peptide-1, GLP-1)受體(GLP-1 receptor， GLP-1R)在胰島素瘤中存在過表達，因此針對GLP-1R的靶向成像成為胰島素瘤分子影像診斷的研究熱點[3]。Exendin-4為GLP-1R激動劑的類似物，研究顯示68Ga標記exendin-4可與GLP-1R發(fā)生特異性結合，用于胰島素瘤特異性診斷[4]。相較于68Ga，18F具有產(chǎn)量高、能量低、半衰期適宜等優(yōu)點，筆者推測18F標記的exendin-4可能具有良好的應用前景，更適用于已配備醫(yī)用回旋加速器的醫(yī)療機構使用。目前，18F標記exendin-4多為動物體內(nèi)研究，鮮見臨床應用報告[5]。本研究擬采用自動化合成模塊探索18F-AlF-1,4,7-三氮雜環(huán)壬烷-1,4,7-三乙酸(1,4,7-triazacyclononane-1,4,7-triacetic acid, NOTA)-馬來酰亞胺(maleimide, Mal)-半胱氨酸(cysteine, Cys)39-exendin-4(簡稱18F-exendin-4)的放射性標記，并完成體內(nèi)顯像驗證，為18F-exendin-4 PET/CT在胰島素瘤診斷中的臨床推廣和應用奠定基礎。
材料與方法
1.儀器設備。 MINItrace醫(yī)用回旋加速器(美國GE公司);All in one多功能化學合成器(比利時Trasis公司);高效液相色譜(high performance liquid chromatography， HPLC)儀(美國Agilent公司)，TC-C18 250 mm×4.6 mm HPLC柱(美國Agilent公司)，HPLC-6111放射性檢測器(美國Eckert & Ziegler公司);Biography mCT Flow 64 PET/CT儀(德國Siemens公司);CRC-55tR放射性活度計(美國Mirion公司);Endosafe PTS內(nèi)毒素快速檢測儀(美國Charles River公司);ESJ120-4電子天平(沈陽龍騰電子有限公司);PHSJ-3F實驗室pH計(上海儀電科學儀器有限公司);移液槍(美國Thermo Fisher公司)。
2.試劑和材料。 HPLC級乙腈、AlCl3、乙酸鈉(成都市科龍化工試劑廠);二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)、冰乙酸(上海麥克林生化科技股份有限公司);三氟乙酸(上海玻爾化學試劑有限公司);抗壞血酸鈉(上海九鼎化學科技有限公司);生理鹽水(四川美大康佳樂藥業(yè)有限公司);滅菌注射用水(四川科倫藥業(yè)股份有限公司);重氧水H218O(豐度為98%，上海化工研究院);胎牛血清(美國Gibco公司);前體NOTA-Mal-Cys39-exendin-4(江西探真生物技術有限公司，純度：99.64%);Plus Light QMA、Plus Light HLB固相萃取柱(美國Waters公司);合成卡套及管路(比利時Trasis公司);PTS內(nèi)毒素快速檢測卡片(美國Charles River公司);0.22 μm無菌濾膜(美國Merck Millipore公司);西林瓶(江蘇華益科技有限公司);精密pH試紙(上海三愛思試劑有限公司)。
3. 18F-exendin-4的自動化合成。 (1) 18F-收集干燥。醫(yī)用回旋加速器生產(chǎn)18F-并傳輸至All in one多功能合成模塊收集管，18F-經(jīng)QMA柱捕獲后，負壓抽取0.5 ml 生理鹽水通過QMA柱將18F-淋洗至反應管。負壓抽取0.5 ml乙腈至反應管，120 ℃加熱共沸2 min，再100 ℃加熱1 min，得干燥18F-。(2)放射性標記。反應管溫度降至70 ℃，負壓抽取前體瓶中的前體溶液(NOTA-Mal-Cys39-exendin-4 500μg溶于50 μl水、2 μl 20 mmol/L AlCl3溶液、400 μl 0.5 mol/L pH值4冰乙酸/乙酸鈉緩沖液、550 μl DMSO)至反應管，100 ℃加熱密封反應20 min，反應完成后降溫至70 ℃待轉出。(3)純化及制劑化。預留30 ml水(含100 mg 抗壞血酸鈉)，注射器先抽取其中10 ml水至反應瓶稀釋反應液，轉出至HLB柱純化，再抽取瓶內(nèi)10 ml水沖洗HLB柱，重復2次。然后抽取2 ml 體積分數(shù)50%乙醇溶液淋洗HLB柱獲得產(chǎn)品，并通過9 ml含75 mg 抗壞血酸鈉的滅菌注射用水，將產(chǎn)品中乙醇稀釋至
10%以下。產(chǎn)品溶液過0.22μm無菌濾膜，裝入西林瓶待用。合成路線見圖1。
4. 18F-exendin-4的質(zhì)量控制。 (1)性狀。透過鉛窗觀察注射液顏色及澄明度。(2) pH值測定。取微量注射液滴至精密pH試紙測注射液pH值。(3)放射性半衰期測定。按藥典通則1401的方法進行[6]。(4)放化純檢測。色譜分離的流動相為溶劑A(含體積分數(shù)0.1%三氟乙酸的水)和溶劑B(含體積分數(shù)0.1%三氟乙酸的乙腈)。洗脫梯度：0～2min，10%B;2.01～15 min，10%～90%B;15.01～17 min，90%B;17.01～18 min，90%～10%B。流速為1.0 ml/min，柱溫為25 ℃，進樣量為10 μl，紫外檢測波長為220 nm。(5)穩(wěn)定性檢測。取370 MBq 18F-exendin-4分別加入生理鹽水及胎牛血清，37 ℃溫育，于0、1、2、4 h通過HPLC檢測穩(wěn)定性。(6)細菌及內(nèi)毒素檢測。按藥典通則1101方法進行無菌檢測[5]。按內(nèi)毒素檢測卡片說明書進行內(nèi)毒素檢測。
5. 18F-exendin-4 PET/CT 顯像。 患者女，55歲，5年前出現(xiàn)晨起后低血糖發(fā)作伴意識障礙，持續(xù)約10 min，排除癲癇相關疾病。CT、超聲等未見明顯異常，MRI結果顯示，胰腺體部見一稍長T1稍長T2信號結節(jié)影，長徑約15 mm，考慮胰島素瘤。患者晨起進食后于本科簽署知情同意書并行18F-exendin-4 PET/CT顯像。顯像時，患者全程持續(xù)滴注質(zhì)量分數(shù)10%葡萄糖注射液，并分別于注射前、注射后20 min以及注射后50 min監(jiān)測指尖血糖。按體質(zhì)量4.44 MBq/kg的劑量進行18F-exendin-4靜脈注射后，患者平躺休息，于注射后30 min及60 min進行圖像采集，采集范圍分別為腹盆部及全身(至股骨下緣)。使用Flow模式進行全身采集。CT采集參數(shù)：管電壓120 kV，管電流自動mA，層厚3.0 mm，層間距2.0 mm，螺距0.8 mm。圖像重建方法為TrueX+飛行時間，經(jīng)計算機2次迭代、每次迭代21個子集重建，矩陣大小256×256。通過德國Siemens syngo VH210，TrueD工作站進行圖像融合和SUVmax測定。該項目經(jīng)四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院倫理委員會審查并批準(批準號：2023年第375號)。
6.統(tǒng)計學分析。 數(shù)據(jù)采用IBM SPSS 22.0軟件進行分析，符合正態(tài)分布的定量資料以x±s表示。
結 果
1. 18F-exendin-4自動化合成。 回旋加速器生產(chǎn)的18F-分別為2.67×104MBq、2.82×104 MBq、2.96×104 MBq，利用All in one多功能化學合成器完成自動化合成(n=3)，分別得到4.92×103MBq、4.29×103 MBq、5.44×103 MBq 18F-exendin-4。標記耗時約40 min，計算未衰減校正的產(chǎn)率為(18.03±2.67)%。比活度>39.74 GBq/μmol，放射性濃度分別為447.27、390.00、494.55 MBq/ml。
2. 18F-exendin-4質(zhì)量控制。 注射液為無色透明液體，無肉眼可見懸浮物。pH值為6.5，放射性半衰期為109 min。HPLC示9.8 min附近可見一紫外吸收峰，10.3 min附近可見一放射性峰，測得產(chǎn)品放化純分別為96.82%、97.08%、96.47%。穩(wěn)定性結果顯示，4 h后18F-exendin-4在生理鹽水及胎牛血清中的放化純依然>95%。細菌培養(yǎng)結果顯示，產(chǎn)品為無菌;內(nèi)毒素檢測結果顯示，每1 ml產(chǎn)品內(nèi)毒素<15內(nèi)毒素單位(endotoxin unit, EU)。
3. 18F-exendin-4 PET/CT顯像。 患者注射前、注射后20 min以及注射后50 min的指尖血糖分別為4.94、4.43和4.02 mmol/L。注射后30 min行PET/CT腹盆部顯像，結果顯示胰腺體部見結節(jié)狀18F-exendin-4高攝取，大小約13 mm×15 mm，SUVmax約5.9。注射后60 min的全身顯像結果顯示，18F-exendin-4高攝取病灶的位置及大小與30 min顯像相同，SUVmax約7.5。PET/CT顯像圖如圖2所示。查詢醫(yī)院病例系統(tǒng)中該患者的術后病理結果，顯示胰腺包塊為腫瘤性病變;腫瘤細胞免疫組織化學結果顯示，人角蛋白抗原決定簇5.5(+)、CD10(+)、CD56(+)、CD99(+)、嗜鉻粒蛋白A(+)、細胞角蛋白(核旁點狀+)、G1/S-特異性周期蛋白D1(部分+)、上皮膜抗原(-)、胰島素瘤相關蛋白1(+)、細胞增殖核抗原Ki-67(約4%+)、孕激素受體(+)、突觸素(+)、波形蛋白(-)、β-連環(huán)蛋白(包膜+、胞質(zhì)+)，符合NEN(G2)特征。
討 論
胰島素瘤診斷的影像學技術有：腹部超聲、超聲內(nèi)鏡、CT、MRI等，但在實際臨床應用中均有不足之處。而核醫(yī)學分子影像能夠準確反映病理生理過程中機體發(fā)生的功能及生物學變化，是胰島素瘤靶向診斷的又一利器。傳統(tǒng)的NEN顯像劑，如奧曲肽類似物，對生長抑素受體(somatostatin receptor, SSTR)2具有較高的親和力，對SSTR3、SSTR4和SSTR5具有不同程度的親和力[7]。但多數(shù)胰島素瘤不表達SSTR2或SSTR5，因此使用奧曲肽類似物進行胰島素瘤診斷的結果可能為假陰性[8]。6-18F-氟-L-多巴(6-18F-fluoro-L-dopa,18F-DOPA)可反映胰島細胞內(nèi)芳香族L-氨基酸脫羧酶的活性，其代謝程度與胰島β細胞合成分泌胰島素的能力呈正相關。但由于18F-DOPA在胰腺本底水平高，不易區(qū)分正常與病灶組織，且顯像靈敏度報道不一，目前僅作為胰島素瘤的二線診斷方法[9]。基于GLP-1R的68Ga-exendin-4 PET/CT顯像對胰島素瘤具有較強的診斷效能，已獲廣泛的臨床認可[10]。由于18F在半衰期、產(chǎn)量、能量方面較68Ga更具優(yōu)勢，因此探索一種簡便、高效的18F-exendin-4自動化合成方法并用于臨床實踐，對今后其在胰島素瘤診斷中的臨床推廣具有重要意義。
本研究選擇NOTA-Mal的雙鍵與Cys39-exendin-4的巰基進行加成反應，得到NOTA-Mal-Cys39-exendin-4，作為標記前體[11]，并通過Al18F一步法標記，得到18F-exendin-4。利用All in one多功能化學合成器自動化合成18F-exendin-4，相較于N-2-(4-18F-氟苯甲酰氨基)乙基馬來酰亞胺[N-(2-(4-18F-fluorobenzamido)ethyl)maleimide,18F-FBEM]-Cys39-exendin-4的合成[12]，不需要半制備HPLC純化，非衰減校正的平均產(chǎn)率達18.03%，放射性標記耗時約40 min，且產(chǎn)品放化純>96%，具有更強的可控性和實用性。對于產(chǎn)品的性狀、pH值、細菌、內(nèi)毒素等指標，檢測后均符合《中華人民共和國藥典(2020年版)》標準。為避免乙醇對血管內(nèi)壁的刺激性，本研究通過含抗壞血酸鈉的滅菌注射用水將產(chǎn)品原液稀釋至11 ml，產(chǎn)品的乙醇含量降至9.09%。患者注射過程中，未出現(xiàn)明顯的刺激性疼痛，顯像圖像未見明顯血管顯影。
18F-exendin-4 PET/CT顯像中，患者腎及膀胱出現(xiàn)18F-exendin-4生理性濃聚，提示藥物主要通過腎排泄，與動物實驗研究結果一致[13]。與68Ga-exendin-4的PET/CT圖像對比顯示，2種顯像劑在腎及膀胱均有濃聚，肝、脾可見輕微均勻性攝取，胰腺病變部位顯像劑濃聚灶清晰，總體顯像效果無明顯差別[14]。患者胰腺體部見結節(jié)狀18F-exendin-4高攝取，術后病理及腫瘤細胞免疫組織化學證實符合NEN(G2)特征，表明18F-exendin-4對GLP-1R具有較強的靶向性，適用于胰島素瘤的特異性診斷。30 min及60 min的采集圖像顯示，病變部位SUVmax從5.9升至7.5，提示18F-exendin-4注射后60 min采集圖像，病灶對顯像劑的濃聚更高，更利于胰島素瘤的診斷，但早期30 min的顯像也基本滿足診斷需求。由于胰島素瘤患者易自發(fā)低血糖，禁食會加重低血糖反應，候檢時應全程保持質(zhì)量分數(shù)10%葡萄糖注射液滴注并定時監(jiān)測血糖水平，以保障就醫(yī)安全。注射前、注射后20 min及注射后50 min的指尖血糖監(jiān)測結果顯示，該患者的血糖波動控制在1 mmol/L以內(nèi)，總體可控。先前的文獻表明，由于飲食可能導致小腸分泌GLP-1，從而與68Ga-exendin-4競爭性結合GLP-1R，為保證顯像質(zhì)量，建議禁食后2 h再進行68Ga-exendin-4 PET/CT顯像[15]。但在本研究中，患者行18F-exendin-4 PET/CT顯像時未嚴格禁食即注射候檢，胰腺病灶清晰可見且顯像劑濃聚高，未見進食帶來的明顯影響。針對上述情況，患者使用exendin-4類似物進行顯像時是否嚴格禁食，需納入更多病例進一步研究，以形成技術規(guī)范。
綜上所述，本研究利用All in one多功能化學合成器探索了18F-exendin-4的自動化合成，該合成方法簡便、耗時少，且產(chǎn)率穩(wěn)定，放化純高。PET/CT顯像結果表明，18F-exendin-4在胰島素瘤的診斷中具有臨床應用價值，且安全可靠，適宜在配備醫(yī)用回旋加速器的醫(yī)療機構推廣使用，但由于顯像病例少，該顯像的相關技術規(guī)范還需進一步研究擬定。
