近年來隨著分子生物學和基因工程等生物醫學技術的飛速發展，多種由于基因缺陷而導致的疾病，如鐮狀細胞貧血、帕金森病、某些自身免疫缺陷性疾病以及腫瘤等逐漸被認識，使人們不僅對該疾病的發病機制有了更深入的了解，也使得基因治療得以不斷地發展。經過數十年的研究和發展，基因治療目前已從單純的實驗室研究轉向多種人類疾病的治療，并取得了令人矚目的成就。前期的臨床試驗已證實基因治療用于人類疾病的可行性和安全性，但目前為止臨床Ⅱ/Ⅲ期試驗的效果還不盡如人意。主要問題之一就是如何在活體條件下無創地進行目標組織或器官中治療基因的表達及治療療效的監測，這也是目前分子影像學研究的熱點之一。

報告基因顯像是近年來迅速發展的一種無創、靈敏的可在活體條件下實時監測治療基因表達的方法，特別是放射性核素報告基因顯像(SPECT/CT和PET/CT等) 具有空間分辨率好、靈敏度高和特異性強的優點，近年來得到了快速的發展，并展示了良好的應用前景[1-5]。本文僅就放射性核素報告基因顯像用于監測基因治療的原理、特點及應用進行綜述。

Part.1

核素報告基因的概念及特征

報告基因是一種可編碼易被檢測的蛋白質的基因，其與目的基因融合后表達的產物可用來顯示目的基因的表達。報告基因系統的基本組成主要包括啟動子和報告基因兩個密不可分的部分，其中報告基因編碼易檢測的蛋白質，而啟動子則調控報告基因表達。通過將報告基因與治療基因重組的報告基因系統導入靶細胞內，在調控序列的控制下兩者進行同步表達，其中報告基因的表達產物可通過放射性核素標記的探針進行檢測，從而直觀地“報告”目的基因的表達情況。所以，通過報告基因的成像可以間接實現對治療基因表達的監測[6]。

作為放射性核素報告基因，應具備以下特征：報告基因產物無抗原性;報告基因應不存在于宿主中或易于與內源性基因相區別;報告探針可以被報告基因表達產物特異性地攝取;報告基因能長期、穩定、安全地表達，且表達水平與治療基因一致;載體、報告基因產物和探針不影響治療基因的表達和靶細胞的正常生理功能;報告探針應能迅速從血液中清除等。但目前已知的報告基因系統均難于滿足上述所有條件，有待今后開發更為有效的報告基因系統，滿足不同基因治療監測的需要[7]。

Part.2

核素報告基因的分類

目前常用的報告基因有多種，可按編碼產物不同分類。以酶為基礎的報告基因包括單純皰疹病毒Ⅰ型胸苷激酶(herpes simplex virus-Ⅰthyminekinase，HSV1-tk) 報告基因及人線粒體胸苷激酶2( human thymidine kinase-2，hTK2) 報告基因等;以轉運體為 基礎的報告基因包括人鈉碘同向轉運體(human sodium-iodide symporter，hNIS) 報告基因、人去甲腎上腺素轉運體 (human norepinephrine transporter，hNET)報告基因等;以受體為基礎的報告基因包括人 多巴胺D2受體( human dopamine D2receptor，hD2R) 報告基因和人生長抑素2型受體(human somatostatinreceptor-2，hSSTR2) 報告基因等[8,9](表 1) 。

Part.3

核素報告基因的應用

放射性核素報告基因目前在基因治療中得到了廣泛應用，并取得了良好的效果;但每種報告基因均有其優勢和不足。

3.1 酶報告基因

3.1.1 HSV1-tk 基因

HSV1-tk 基因是目前使用最普遍、研究最成熟的放射性核素報告基因顯像系統。HSV1-tk 能編碼催化磷酸化的酶，使放射性核素標記的該酶底物包括各種嘌呤及嘧啶底物或其類似物磷酸化，磷酸化后的底物不能穿出細胞膜外而聚集于細胞內，從而通過核醫學儀器進行顯像。其底物也是核苷類的前體藥物(如阿昔洛韋、無環鳥苷、更昔洛韋等) ，因此 HSV1-tk 基因同時也是非常重要的治療基因，可用于腫瘤等的基因治療[10]。Jacobs 等[11]在一項復發性膠質母細胞瘤的臨床Ⅰ～Ⅱ期基因治療研究中，向瘤內注射脂質體基因復合物 LIPO-HSV1-tk，以更昔洛韋作為前體藥物，利用124I-FIAU PET 顯像監測基因表達。5 例患者中，1 例基因治療有效，PET 顯示腫瘤內124I-FIAU 特異性攝取;更昔洛韋治療后，FDG( 氟代脫氧葡萄糖) -PET 和 MET( 甲基-L-蛋氨酸) -PET 顯示該區域組織壞死; 其他 4 例治療無效患者，PET 顯示腫瘤內無124I-FIAU 攝取;研究表明，通過 HSV1-tk 報告基因探針的 PET 成像，可用于腫瘤基因治療的監測。之后，Penuelas 等[12]在一項臨床前期試驗中，向肝癌患者瘤內注射以腺病毒為載體的 HSV1-tk 基因( AdCMVtk) ，2d后以18F-FHBG 作為報告探針進行 PET-CT 核素顯像，結果發現所有瘤內注射超過 1 × 1012病毒顆粒的患者均能監測到瘤內基因表達，且在遠處臟器和周圍肝硬化組織中均未發現特異性的基因表達，證明了HSV1-tk基因用于腫瘤基因治療以及18F-FHBG 用于監測治療基因表達具有可行性。以 HSV1-tk 基因作為報告基因的一大優勢是酶基因的表達產物可介導信號的級聯放大，敏感性高，利于信號探測; 但因 HSV1-tk 報告基因是一種非人類基因，臨床應用中可產生針對該基因轉導的細胞或者組織的免疫反應[4，13]，影響其重復使用和長期監測。Kang 和 Likar 等[14，15]分別在研究中發現，HSVl-tk 基因的突變型——HSV1-sr39tk和HSV1-A167Ysr39tk 基因對標記探針 FEAU 具有更高的親和力和催化效能，且免疫原性較低，預示了較好的應用前景。

3.1.2 hTK2 基因

由于 HSV1-tk 基因作為非人源基因，其產物易引起人體免疫反應，因此一種新的具有與 HSV1-tk 報告基因相似的人源性報告基因——hTK2 基因正日益受到關注。在非復制型細胞中，細胞基質內的脫氧核苷酸合成下調，線粒體 DNA 只能依靠線粒體補救旁路酶來合成，而 hTK2 即是 4 種表達在線粒體內的脫氧核苷酸激酶之一[16]。hTK2 同樣具有磷酸化脫氧胞苷、脫氧胸苷、脫氧尿苷以及多種核苷類似物的功能[17]。由于 hTK2 基因高表達，并能從線粒體到達胞質內進行再定位，且不受線粒體內膜的阻礙，提高了對報告探針磷酸化的生物利用度，并能長期監測目的基因的表達[4]，展示了良好的臨床應用前景。研究發現，一種在 N 端截短了 18個氨基酸的 hTK2 ( ΔhTK2) 具有比 hTK2 更好的生物效能。Ponomarev 等[18]通過重組反轉錄病毒介導ΔhTK2-GFP 基因感染神經膠質瘤細胞的體內外研究顯示，ΔhTK2 在被感染細胞的胞質內成功表達，且124I-FIAU 和18F-FEAU 在裸鼠移植瘤內的濃聚水平是對照組的 6 倍以上。另外，此項研究同時探索了ΔhTK2 基因激活多種抗腫瘤前體藥物對腫瘤細胞的基因治療效果，發現阿糖胞苷在 0.04 μmol 水平時即對 ΔhTK2 感染的腫瘤細胞具有 50% 抑制濃度( 即IC50 = 0.04 μmol) ，而對照組則需 0.26 μmol。以上研究結果證明，利用 ΔhTK2 基因進行基因治療及其監測具有可行性。

3.2 轉運體報告基因

3.2.1 hNIS 基因

hNIS 是位于甲狀腺濾泡細胞膜上的一種跨膜糖蛋白，可利用 Na+-K+-ATP 酶提供的能量促進碘離子的主動轉運，使碘離子順著電化學梯度從間質進入細胞。除甲狀腺組織外，hNIS 也在唾液腺、胃黏膜、脈絡膜、分泌期的乳腺等組織器官中低水平表達[19]。hNIS 基因既是報告基因，同時也可作為治療基因。分化型甲狀腺癌細胞高水平表達 hNIS，因此可進行131I 的治療; 而對于非甲狀腺組織腫瘤，可將 hNIS 基因通過病毒等載體轉染入腫瘤細胞，使其表達 hNIS，進而可通過131I 進行治療[20]。Barton 等[21]在臨床Ⅰ期試驗中，將重組有 2 個自殺基因和 NIS 報告基因的溶瘤腺病毒( Ad5-yCD/mut-TKSR39rep-hNIS) 轉染前列腺癌，并 行 SPECT/PET顯像。研究結果表明，78% (7/9) 的患者腫瘤內 hNIS基因表達時間可長達 1 周以上，表達高峰在注射后的1～2d，且前列腺外組織器官未見 hNIS 基因表達。因此，首次在人體內證實，hNIS 報告基因可用于基因治療以及病毒載體的體內生物分布的監測。與其他放射性核素報告基因相比，hNIS 具有諸多優勢：hNIS 是內源性基因，其編碼產物是一種生理性蛋白，理論上無免疫原性;hNIS 報告基因的表達產物在胞膜上，較 HSV1-tk 等胞內酶類的報告基因更易捕獲報告探針;內源性的 hNIS 基因僅在幾個特定的組織和器官表達;hNIS 的底物報告探針為常用放射性核素，如123I、99mTc 等核素，無需標記，價格便宜，易于獲取;可用于常用核醫學顯像儀器 SPECT 或 PET 顯像;hNIS 作為報告基因，較 SSTR2 和 hD2R 等具有更好的穩定性[4，22]。但 hNIS 報告基因也存在某些不足，如 hNIS 基因為內源性基因，某些器官組織如甲狀腺、胃黏膜、乳腺、唾液腺等均有不同程度的表達，影響了 hNIS 基因表達的監測;另外，對于非甲狀腺組織細胞，hNIS 基因介導放射性碘攝取后，因缺少甲狀腺組織特有基因，不能使碘離子有機化而有效滯留，排出較快，盡管減少了組織的輻射損傷，但同時也影響了信號的探測[20，23，24]。

3.2.2 hNET 基因

hNET 是位于細胞膜上的一種跨膜蛋白，能介導去甲腎上腺素、腎上腺素和多巴胺等兒茶酚胺類物質跨膜轉運。hNET 主要分布于中樞及外周交感神經系統(如腦、心臟等) 。因其僅在體內特定的器官和組織內表達，hNET 被視為具有應用潛力的報告基因[25]。另外，hNET 也是一種生理性的跨膜蛋白，不引起體內免疫反應，具有體內長期安全監測的優勢[26]。Moroz 等[26]以反轉錄病毒為載體，構建了pQCX-hNET-IRES-GFP 重組病毒，以hNET 基因作為報告基因，GFP 基因代替治療基因進行治療基因的監測研究。體外研究顯示，感染的三種細胞系的 GFP 熒光表達強度與報告探針 MIBG 攝取呈正相關;體內研究顯示，124I-MIBG 小動物PET顯像較123I-MIBG SPECT顯像 更具優勢，主要是由于124I的半衰期長，且體內組織的放射性核素清除速度比124I-MIBG 快 5 倍多，在注射124I-MIBG 48h 和72h后，腫瘤/肌肉放射性活度比分別達49∶1 和130∶1，從而在延遲顯像中使腫瘤顯像更清晰。該研究表明，hNET 作為核素報告基因監測治療基因的表達具有可行性。在另一項研究中，Buursma 等[27]構建重組腺病毒載體 AdTrack-hNET，以 hNET 基因作為報告基因，EGFP 基因代替治療基因。注射報告探針11C-mHED 后進行 PET 核素顯像和 EGFP 熒光顯像，發現11C-mHED 攝取值和 EGFP 熒光強度呈正相關，同樣也證明了 hNET 作為報告基因監測共表達的治療基因的可行性。hNET 作為人源的轉運體類報告基因，與 hNIS 基因具有相似的優缺點[4,26 - 29]。

3.3 受體報告基因

3.3.1 hD2R 基因

hD2R 在體內主要分布在紋狀體和垂體，是少數能夠進行腦內細胞示蹤的放射性核素報告基因系統之一[30]。18F-FESP 等報告探針脂溶性高，可以通過血腦屏障與 hD2R 受體結合，具有較高的親和力。故通過重組 hD2R 基因的病毒載體轉染腫瘤細胞后，以18F-FESP 為探針，可在活體條件下通過 PET 顯像進行治療基因表達的監測。Liang等[31]以腺病毒為載體構建了hD2R 基因、內部核糖體進入位點(internal ribosomal entry site，IRES) 序列和 HSV1-sr39tk 基因的重組病毒，經小鼠尾靜脈分別注射 hD2R 的報告探針18F-FESP 及 HSV1-sr39tk 的報告探針18F-FHBG 后，micro-PET 顯像可見肝臟內兩者的放射性攝取具有相關性。研究顯示，通過 hD2R報告基因 PET 成像可在活體條件下無創、定量及重復地進行治療基因表達的監測。然而，由于 hD2R 受其受體飽和性的影響，敏感性相對較低[32]。另外，hD2R 還可造成 G 蛋白耦聯受體介導的細胞內信號通路的激活，導致靶細胞或組織的生理學變化;而突變型的hD2R( D2R80A 和 D2R194A) 則避免了相關生物學效應的產生，同時又具有與18F-FESP 等報告探針相同的親和力[30，33，34]，因此，具有更好的應用前景。

3.3.2 hSSTR2 基因

hSSTR 在體內主要分布在垂體前葉、軟腦膜、胰腺、胃腸道黏膜、腎和肺等組織器官，共有 5 種亞型( 1、2a、2b、3、4 和 5 型)，hSSTR2 與腫瘤的關系最為密切[35]。生長抑素或生長抑素類似物( somatostatin analogue，SSA) 通過與腫瘤( 如各種神經內分泌腫瘤、類癌等) 細胞表面的 hSSTR2 結合，抑制其增 殖，從而達到治療目的[36，37]。對于某些hSSTR2 表達缺失或低表達的腫瘤，如胰腺癌，可通過轉基因的方法，將 hSSTR2 基因導入腫瘤細胞內，使之表達 hSSTR2，便可通過 SSA 進行基因治療。同時也可通過放射性核素標記的 SSA ( 如111In-奧曲肽、99mTc-P829 等) 進行腫瘤 hSSTR2 表達的顯像，進行基因治療的監測[4，35]。Zinn 等[38]利用雙啟動子方案，構建了編碼 hSSTR2a 基因和 HSV1-tk 基因的重組腺病毒 Ad-pCMV-hSSTR2a-pCMV-HSV1-tk，感染人肺 癌細胞 A427 后發現，細胞攝取99mTc-P2045( hSSTR2a 配體) 和125I-FIAU ( HSV1-tk 配體) 的放射性之間具有相關性，表明 hSSTR2 報告基因系統用于治療基因表達的監測具有可行性。同樣，hSSTR2 基因作為內源性基因，其表達產物不會產生免疫反應;但 hSSTR2 也會激活細胞內信號通路。Han 等[39]構建了突變型的 HA-SSTR2 Δ314 報告基因，消除了hSSTR2 相關生物學效應的影響，其表達產物不會引起細胞內 cGMP 和 cAMP 的變化，對細胞增殖亦無影響，是一種更具前景的報告基因。

Part.4

結語

盡管每種報告基因系統都有其自身的優勢和不足，例如 HSV1-tk 報告基因具有信號放大作用，靈敏度高，易于信號檢測，但因非人源性基因，其表達產物可引起機體的免疫反應;而 hNIS 雖無免疫源性，但受到受體飽和性的影響，其敏感性較低，且背景信號干擾較多。隨著人類基因治療和分子顯像技術的發展，新的或改良的報告基因系統、雙報告基因系統甚至是多報告基因系統的研究和運用，有望解決這些問題。盡管大部分基因治療和報告基因顯像監測尚處在試驗階段，但隨著基因治療和分子影像技術的不斷發展，放射性核素報告基因顯像在基因治療的監測方面將會取得長足的發展。