背景介紹
成纖維細胞激活蛋白(Fibroblast activation protein, FAP)在多種上皮癌微環(huán)境中的腫瘤相關(guān)成纖維細胞(cancer associated fibroblasts, CAFs)中高表達，與腫瘤細胞的生長、侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)，而在正常成人靜息的成纖維細胞及良性腫瘤間質(zhì)中通常不表達。近年來研發(fā)的各種放射性FAP靶向劑在已報道的PET成像研究中顯示出良好的應(yīng)用前景。OncoFAP是一種親和力較高的小分子FAP靶向劑，在幾種原發(fā)和轉(zhuǎn)移性實體惡性腫瘤患者中具有良好的成像效果。
提高靶向FAP的核素內(nèi)照射治療的療效是目前的研究熱點之一，其關(guān)鍵問題是提高放射性配體在腫瘤病灶中的滯留時間。目前已研發(fā)的放射性FAP靶向劑在病灶中的滯留時間短，限制了其治療效果。前期研究證明配體的二聚體化是延長配體在抗原陽性結(jié)構(gòu)中停留時間的一種有效方法。因此，作者制備了一種OncoFAP的二聚體衍生物——BiOncoFAP。在本研究中，作者報告了177Lu-BiOncoFAP的放射合成、其在小鼠腫瘤模型中的生物分布以及治療結(jié)果。
設(shè)計思路
在臨床前體外實驗中，作者研究了OncoFAP、BiOncoFAP及幾種共軛化合物的化學(xué)合成、放射性化學(xué)標記方法、產(chǎn)率及放化純度，還評估了幾種化合物的體外穩(wěn)定性、親和力和水溶性等。在臨床前體內(nèi)實驗部分，作者研究了177Lu-BiOncoFAP在小鼠腫瘤模型(雙側(cè)腫瘤模型：左側(cè)FAP陰性腫瘤、右側(cè)FAP陽性腫瘤)中的生物分布和治療效果，并與177Lu-OncoFAP進行對比。
數(shù)據(jù)分析
作者合成了OncoFAP及其相應(yīng)的共軛化合物(OncoFAP-Fluorescein、OncoFAP-Alexa488、OncoFAP-IRDye750和OncoFAP-DOTAGA)。BiOncoFAP由OncoFAP的靶向部分和賴氨酸縮聚而成，游離的羧酸與熒光素、螯合劑DOTAGA反應(yīng)得到BiOncoFAP-Fluorescein、BiOncoFAP-Alexa488、BiOncoFAP-IRDye750和BiOncoFAP-DOTAGA。使用177Lu核素對OncoFAP-DOTAGA和BiOncoFAP-DOTAGA進行放射性標記。PD-10共洗脫實驗顯示177Lu-OncoFAP 和177Lu-BiOncoFAP 保留了與hFAP結(jié)合的能力，且兩者都具有高親水性。上述幾種化合物的化學(xué)合成方案如圖1所示。
圖1、OncoFAP、BiOncoFAP和相應(yīng)幾種共軛化合物的化學(xué)合成方案。
與OncoFAP-DOTAGA和其冷標記衍生物[natLu]Lu-OncoFAP-DOTAGA相比，BiOncoFAP-DOTAGA和[natLu]Lu-BiOncoFAP-DOTAGA顯示出更強的抑制活性(圖2. A, B)。隨后，作者用熒光偏振分光光度法測定了OncoFAP-Fluorescein和BiOncoFAP-Fluorescein與hFAP結(jié)合的親和力常數(shù)，兩者的KD值分別為795和781 pM(圖2. D, E)。此外，OncoFAP和BiOncoFAP與hFAP結(jié)合的特異性都較強。因此，二聚化沒有降低BiOncoFAP與靶點結(jié)合的親和力和特異性。接下來，作者又研究了OncoFAP和BiOncoFAP在固體載體上與hFAP的結(jié)合特性(圖2. C)。競爭ELISA結(jié)果顯示BiOncoFAP-Fluorescein的KD值低于OncoFAP-Fluorescein(圖2. F)。OncoFAP和BiOncoFAP與腫瘤細胞的結(jié)合特征相似;在SK-RC-52細胞上未觀察到二者的內(nèi)化，而在HT-1080細胞上觀察到高膜轉(zhuǎn)運率(圖2. G-J)。
圖2、OncoFAP和BiOncoFAP的體外親和力實驗。compound 1: OncoFAP-DOTAGA; compound 2: [natLu]Lu-OncoFAP-DOTAGA; compound 4: BiOncoFAP-DOTAGA; compound 5: [natLu]Lu-BiOncoFAP-DOTAGA; compound 7: OncoFAP-Fluorescein; compound 8: BiOncoFAP-Fluorescein; compound 9: OncoFAP-Alexa488; compound 10: BiOncoFAP-Alexa488。
在37 °C的人和小鼠血清中孵育[natLu]Lu-BiOncoFAP-DOTAGA 24、48、72和120 h，所有實驗條件下natLu-BiOncoFAP-DOTAGA的半衰期均超過5天，且均未檢測到natLu脫標。接下來，作者在皮下接種SK-RC-52(左肩，F(xiàn)AP陰性)和SK-RC-52-hFAP(右肩，F(xiàn)AP陽性)的小鼠中觀察OncoFAP-IRDye750和BiOncoFA-IRDye750的生物分布。OncoFAP-IRDye750和BiOncoFAP-IRDye750均在FAP陽性腫瘤中聚集，但BiOncoFAP-IRDye750在腫瘤部位的滯留時間更長?；诖私Y(jié)果，作者在皮下接種HT-1080(左肩，F(xiàn)AP陰性)和HT-1080-hFAP(右肩，F(xiàn)AP陽性)的小鼠模型中觀察了177Lu-OncoFAP和177Lu-BiOncoFAP的生物分布。靜脈注射后不久，兩種化合物在FAP陽性腫瘤中特異性聚集。全身給藥后24 h后，177Lu-OncoFAP的腫瘤攝取約4 %ID/g，177Lu-BiOncoFAP的腫瘤攝取約為20 %ID/g，177Lu-BiOncoFAP表現(xiàn)出更持久的腫瘤滯留(圖3. C, D)，且177Lu-BiOncoFAP在正常器官中的攝取更低，腫瘤/器官比值高。圖3. E, F所示為兩種放射性化合物的腫瘤/器官比值，注射24 h后，177Lu-BiOncoFAP的腫瘤/腎臟比值為12:1，腫瘤/肝臟比值為34:1。
圖3、177Lu-OncoFAP和177Lu-BiOncoFAP臨床前生物分布實驗。
最后，作者比較了177Lu-OncoFAP和177Lu-BiOncoFAP對接種HT-1080(左肩，F(xiàn)AP陰性)和HT-1080-hFAP(右肩，F(xiàn)AP陽性)小鼠體內(nèi)腫瘤的治療作用。與生理鹽水組相比，兩種放射性化合物在治療劑量(250 nmol/kg)下均能有效地抑制FAP陽性腫瘤的生長，而177Lu-BiOncoFAP效果更好(圖4. A)。而177Lu-OncoFAP和177Lu-BiOncoFAP對于FAP陰性腫瘤無明顯治療效果(圖4. B)。
圖4、177Lu-OncoFAP和177Lu-BiOncoFAP臨床前治療實驗。
總結(jié)與展望
在本研究中，177Lu-BiOncoFAP與FAP結(jié)合具有穩(wěn)定的高親和力和特異性，在腫瘤病灶中的滯留時間長，并具有高腫瘤/器官比例。在給予治療劑量后，177Lu-BiOncoFAP可有效抑制FAP陽性腫瘤的生長。本文中將小分子配體二聚體化以提高放射性配體在腫瘤中滯留時間的方法值得學(xué)習(xí)。但要注意的是，普遍認為FAP表達在腫瘤間質(zhì)中，且基質(zhì)和腫瘤細胞分布不均勻，而此項研究中所使用的細胞系FAP直接表達在腫瘤細胞表面，所以該腫瘤治療效果只能作為參考，期待后續(xù)研究結(jié)果。
