血液輻照是采用射線對全血及成分血進行照射，利用電離輻射直接損傷具有免疫活性的T淋巴細胞或其他目標細胞中的DNA，進而減少輸血不良反應的發生。研究發現利用血液輻照技術可以有效的對塞卡病毒、朊病毒、埃博拉病毒、新型冠狀病毒進行滅活，是有效阻斷病毒傳播的方式。伽馬射線輻照是最常見的血液輻照方法，對血小板來說，輻照劑量通常為25～30 Gy，可以有效減少血小板病原體污染，預防血小板輸血相關的移植物抗宿主病，伽馬射線輻照是滅活血小板中殘留的其他免疫細胞及病毒污染簡便快捷的方法。

早期研究表明伽馬射線輻照不會對血小板功能造成明顯的損傷，但是近年來隨著檢測手段的進步及檢測指標的日益完善，發現伽馬射線輻照對血小板貯存損傷有一定的影響(見圖1)，血小板貯存損傷(PSL)是指血小板在體外保存過程中，血小板的結構和功能發生的一系列改變，這些變化的總和被概括為血小板貯存損傷。血小板貯存損傷主要表現為以下幾個方面：首先是在保存過程中由于新陳代謝產生的乳酸及活性氧(ROS)積累在細胞內，導致pH值下降、糖酵解增加、線粒體功能紊亂;其次血小板細胞膜的去極化導致血小板凋亡增加、膜上許多關鍵性的功能蛋白提前活化、膜表面顆粒大量釋放脫落;最后一個方面是血小板形態由圓盤狀變為球狀，致使其粘附及聚集功能下降。這些改變對血小板輸注后在患者體內的存活率和止血功能有巨大影響。本文就伽馬輻照對血小板的蛋白組學、氧化應激、病原體滅活及輸注療效作一簡短回顧。

圖1 伽馬射線輻照引起血小板貯存損傷的機制圖

注：伽馬射線誘導H2O和O2等產生活性氧，包括-OH和O2–，產生的活性氧導致血小板內氧化還原平衡被打破，持續性的氧化應激致使線粒體功能受損，血小板蛋白組學發生改變，基因損傷等，從而引起血小板貯存損傷。

1 伽馬射線輻照對血小板蛋白組學的影響 血小板蛋白質對血小板發揮止血功能有重要的作用，目前已鑒定出4 000余種血小板蛋白質，它們屬于各種亞蛋白組，對血小板生成及功能有重要影響，明確伽馬輻照對血小板蛋白組學的改變具有重要意義。THIELE等采用SDS-PAGE分離、液相色譜串聯質譜LC-ESI-MS/MS蛋白組學技術，比較伽馬射線輻照的血小板(輻照劑量30 Gy)、紫外線照射的血小板(照射劑量(3.9±0.1)J/cm2)以及正常保存的血小板的相關蛋白質譜變化，總共鑒定了948種蛋白質，其中721種是多肽類蛋白質。結果顯示在保存第1天，與正常保存對照組相比：伽馬輻照引起49種蛋白質發生變化，紫外照射引起23種蛋白質發生改變。各組保存5天后，與對照組第一天相比：紫外照射處理引起58種、伽馬射線輻照處理引起50種、對照組本身36種蛋白發生變化。進一步基因分析顯示許多蛋白質的催化活性以及蛋白質與核酸的結合能力受到影響。研究結果表明伽馬射線輻照在第1天引起的蛋白組學變化強于紫外線照射，但在第5天紫外照射處理會導致血小板蛋白損傷增加，總的來說伽馬射線輻照相對紫外照射來說對血小板蛋白貯存損傷的影響相對較小。

伽馬射線輻照對血小板的蛋白質組學的負面影響已有報道。伽馬射線輻照血小板后顯示血小板細胞骨架蛋白水平的改變，如肌動蛋白隨著保存時間的延長而降低。伽瑪射線輻照后第1天顯示蛋白酶體激活劑復合體亞基1亞型2(PACS1I2)的水平較高，該復合體參與DNA損傷修復，調節血小板的細胞形態和細胞骨架重排。伽馬射線輻照可以影響二硫鍵異構酶(ERP72)、金屬蛋白酶組織抑制因子-1(TIMP-1)、膽堿轉運蛋白2(SLC44A2)、肌球蛋白α1鏈(TPM1)、Septin-11、Parvalbumin α等蛋白的活性，進而影響血小板聚集、細胞骨架重排和血小板氧化效應等細胞功能。Rho蛋白是一類相對分子質量為20～25 KD的三磷酸鳥苷(GTP)結合蛋白，又被稱為Rho GTP酶，Rho蛋白及其調控分子在血小板細胞骨架重排方面發揮了至關重要的調控作用，參與了血小板收縮、血小板偽足形成以及血小板顆粒分泌等重要過程。伽馬射線輻照后可以降低血小板Rho二磷酸鳥苷(GDP)解離抑制因子1的相對濃度，它們通過抑制GDP的解離和隨后的GTP與Rho蛋白的結合來調節大多數Rho蛋白的GDP/GTP交換反應。

伽馬輻照可以提高Ras相關蛋白Rap-1b亞型1(Rasrelated protein Rap-1b isoform 1)的表達，該蛋白位于G蛋白偶聯受體(GPCRs)的下游和血小板整合素αⅡbβ3的上游，對血小板的止血功能至關重要。類似地，伽馬輻照可以提高鈣調蛋白的表達，表明伽馬輻照后可以影響血小板對激動劑的反應能力。還發現其他蛋白質在伽馬輻照后的血小板中表達上調，例如腫瘤蛋白翻譯控制1(TPT1)，它可能在血小板的激活中起作用，因為它是一種鈣結合蛋白，參與維持細胞微管的穩定。

2 伽馬射線輻照對血小板氧化應激的影響 活性氧能夠調控血小板活化、聚集、誘導血小板凋亡，是生物體內氧化反應過程中形成的氧自由基，低濃度的活性氧是細胞生長、生存、信號轉導等所必需的胞內信號分子，過量的活性氧會導致氧化應激并引起蛋白質、脂質和DNA發生氧化損傷。活性氧可以通過不同的途徑激活血小板，被認為是血小板貯存損傷的標志之一，血小板產生活性氧有兩個重要的來源，包括通過激活NAPDH(腺嘌呤二核苷酸磷酸)等氧化酶產生的胞漿活性氧和線粒體呼吸作用等生成的活性氧。

研究發現伽馬射線輻照使血小板中殘留的T淋巴細胞失活的同時也會通過不同的機制電離輻射產生活性氧，對血小板的貯存損傷有一定的影響。血小板在正常保存過程中，活性氧和乳酸鹽脫氫酶呈時間依賴型緩慢增高，而谷胱甘肽過氧化物酶和葡萄糖呈時間依賴型逐漸減少。然而NODEH等研究發現伽馬射線輻照當天會加速線粒體產生活性氧，致使血小板內活性氧(H2O2、超氧陰離子)的水平明顯提高，之后活性氧逐漸回調至正常水平，但保存后期活性氧又顯著提高。血小板胞內的谷胱甘肽過氧化物酶水平及上清液中還原型谷胱甘肽的含量在伽馬射線輻照當天顯著降低，而乳酸脫氫酶在胞內的表達下調而上清液中的活性卻在伽馬射線輻照后提高，說明伽馬射線輻照加速了血小板的新陳代謝，增強了氧化應激。分析原因作者認為早期活性氧濃度的增加是伽馬輻照的直接效應，而后續回調至正常水平可能是以消耗血小板內與活性氧清除相關的酶(超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶)為代價獲取的。后期積累的活性氧造成細胞損傷誘導乳酸脫氫酶的釋放，加劇氧化應激的改變，進一步造成血小板貯存損傷。

抗氧化酶蛋白(DJ-1)在血小板氧化應激反應中起主要作用，DJ-1在伽馬射線輻照后過表達。伽馬射線輻照后誘導血小板氧化應激標志物硫醇異構酶(ER-60蛋白酶：催化和協調基于氧化還原蛋白質的二硫鍵修飾，從而調節血小板功能)的表達顯著下調。通過多反應監測質譜法分析上清液中與氧化應激相關代謝物，結果證實經伽馬輻照處理的血小板上清培養液中的代謝率和氧化應激產物增加，此項研究表明伽馬射線輻照可能會加速由于氧化應激引起的血小板衰老。

血小板中線粒體通過電子鏈傳遞(ETC)過程中的氧化磷酸化合成三磷酸腺苷(ATP)，在這個過程中，由于ETC泄漏的電子對氧分子(O2)進行單電子還原而產生超氧陰離子(O2–)。研究表明，在細胞暴露于電離輻射后，線粒體產生的活性氧會導致基因組的不穩定。當細胞暴露于5 Gy伽馬射線輻照后，發現輻照后細胞發生明顯的下列氧化應激時間序列變化：在輻照后幾分鐘內細胞內活性氧水平快速增加，但在30分鐘后活性氧水平逐漸恢復正常，輻照后12小時檢測到線粒體功能障礙，線粒體電子傳遞鏈中調節活性氧釋放的最重要的NADH脫氫酶的活性降低，輻照24小時以后，線粒體產生ROS的能力明顯升高，線粒體DNA氧化明顯增強。輻照后線粒體功能障礙導致的持續氧化應激，可能會加速促進輻照誘導的基因組不穩定。通過給予抗氧化劑使線粒體功能正?；赡苁菧p緩輻照引起的血小板氧化應激、延長血小板保存時間的一種潛在策略。

3 伽馬射線輻照對血小板殘留免疫細胞及細胞因子滅活的影響 發熱性非溶血性反應(NHFTRs)是輸血相關的常見不良反應，大量研究表明，血小板保存過程中會分泌細胞因子，如白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等，血小板中細胞因子水平的升高與發熱性非溶血性輸血反應有關。血小板中細胞因子的來源被認為是受污染的白細胞，特別是單核細胞所產生，因此減少或使血小板中殘留的污染細胞失活是防止細胞因子產生一種重要舉措。

研究表明伽馬射線輻照可以使血小板中受污染的淋巴細胞、部分白細胞失活，從而減少轉化生長因子-β1(TGF-β1)、血小板第四因子(PF4)等細胞因子及趨化因子在血小板保存過程中的產生和積累。在血小板保存過程期間產生的細胞因子中，IL-8是一種重要炎癥介質，當機體受到感染及某些自身免疫性疾病的影響時，由具有Toll樣受體的細胞分泌，并在炎癥局部、血清和體液中顯著增加。但對于伽馬射線輻照血小板后對IL-8的合成與分泌存在一定爭議，POURFATHOLLAH等研究表明經輻照和未輻照的血小板在保存過程中IL-8濃度均有不同程度的升高，但兩者差異無統計學意義，而VOLL研究卻表明在保存5天后，伽馬射線輻照血小板后會抑制p選擇素(CD62p)的表達以及IL-1b和IL-8的分泌。

此外研究發現經伽馬射線照射的外周血單個核細胞(PBMNCs)產生的細胞因子數量與未經處理的白細胞產生的細胞因子數量沒有顯著差異。對術中回收的自體血進行伽馬射線輻照，并對輻照前后血中的促炎介質、腫瘤壞死因子、白介素21β、嗜酸性粒細胞趨化蛋白和單核細胞趨化蛋白進行檢測，結果發現，上述物質并沒有因為輻照而升高。而且經輻照的自體血回輸后，患者體內上述物質的含量很少，較輸注前未明顯上調，從而不會導致免疫炎性反應。

總的來說筆者認為伽馬射線輻照在血小板保存過程中通過抑制細胞因子合成與分泌的途徑從而來減緩免疫反應的效果有限，盡管伽馬射線輻照可以使T淋巴細胞等失活使其不能夠再增殖，可以減少由少量白細胞介導的免疫反應，但不能消除和阻止細胞因子的合成和分泌，甚至有可能產生與未經處理的細胞同等的細胞因子數量。此外FAST和HEDDLE等研究發現在未經刺激、未經處理或伽馬輻照的細胞上清液中檢測到IL-6的水平有可能足以潛在的引發輸血不良反應。

為了有效防止保存過程中血小板中細胞因子的產生和積累，應該使用其他的方法，比如保存前過濾去掉相關免疫細胞，如白細胞去除術。此外以核黃素加入血漿或血小板制品在紫外線作用下對核酸進行靶向修飾從而滅活病毒、細菌、寄生蟲等病原微生物的去除技術，可以導致病原微生物核酸的不可逆性損傷，阻止其增殖，也可通過該機制滅活包括淋巴細胞在內的白細胞，從而有效抑制免疫細胞因子的合成和分泌，但此種方法可能會增加血小板的貯存損傷。

4  伽馬射線輻照對血小板輸注療效的影響 ZHU等研究評估和比較了伽馬輻照機采血小板和非輻照機采血小板在化療引起的血小板減少癥患者中的止血功能、輸血效果和安全性。結果顯示伽馬輻照后對保存期間的血小板計數、平均體積(MPV)、平均分布寬度(PDW)、pH值、血小板低滲休克反應、血小板形態及相關的凝血參數均無顯著影響，在輸血后1小時和24小時的病人的止血相關的功能參數(最大振幅：MA，反應時間：R、Angle角)、輸血后24小時的CCI(血小板輸注后增高指數)均無統計學差異(P>0.05)。兩組均無關于出血、不良事件和急性輸血反應的事件發生?？偟膩碚f伽馬射線輻照血小板后對血小板的止血功能，輸血效率均無明顯影響，但為保證最好的治療效果，建議不論是普通血小板制品還是輻照血小板制品，均應盡早輸注到患者體內。伽瑪射線輻照血小板在常規使用中是安全的，即使是對于免疫功能嚴重受損或接受過干細胞移植的高?；颊咭彩侨绱?，輸注伽馬輻照機采血小板能夠在一定程度上降低患者的體液免疫反應。

但是上述研究同時表明，輸注保存0～3天的伽馬射線輻照的血小板，輸血后1小時CCI及24小時的平均CCI比輸注非輻照的血小板組都低(輻照vs非輻照，1 h：11.59±5.97 vs 12.83±6.33;24 h：5.76±4.05 vs 6.56±4.10)，即使這一差異并無統計學意義，但提示伽馬輻照血小板可能會增加血小板的貯存損傷，導致血小板的輸注療效和CCI降低。此外也有研究表明，未輻照的血小板產生更高的CCI，隨著輻照后保存時間的延長，伽馬射線輻照對CCI的負面影響可能會更加明顯。JULMY等在單變量分析中，預先輻照的血小板的輸血效率為27.7%，而輸注當天輻照的血小板的輸血效率為35.0%，研究表明當天輻照的單采血小板輸注效果明顯優于預先輻照的血小板的輸注效果，兩者存在統計學差異。目前各種指南規定，血小板濃縮物的輻照可以在保存過程中的任何階段進行，但實際上目前有相關研究結果更支持血小板應該在輸血前接受血液輻照并至少在輻照后24小時內進行輸注為最佳，以減少輻照引起的貯存損傷對血小板輸注療效的影響。

5 總結展望 伽馬輻照可以消除血小板中殘留的白細胞對有絲分裂原的反應能力及抑制同種異基因T淋巴細胞分化的能力，因而可以預防HLA抗原同種免疫反應及TA-GVHD。血液制品的最佳輻照劑量應以既能滅活淋巴細胞又能維持其他血液成分的功能與活力以及最小的損傷為選擇，何其通等探討不同劑量輻照后淋巴細胞的滅活和對血小板功能的影響，發現劑量達到35 Gy時，對淋巴細胞的滅活效果顯著且對血小板的臨床止血效果沒有明顯影響，但過高劑量的伽馬射線輻照或者輻照后保存時間過久，均會對血小板的貯存損傷造成影響，目前已經明確的機制有：伽馬射線輻照可以通過誘導H2O和O2等方式產生活性氧，破壞血小板內氧化還原平衡，造成氧化應激致使線粒體功能受損，血小板蛋白組學發生改變，基因發生氧化損傷。

輻照對血小板的產品質量有一定的影響，因此對于不同類型的病人是否需要接受輻照血小板輸注這一關鍵問題，2020年8月英國血液病學學會(BSH)發布了輻照成分血的應用指南，對于有先天性T細胞免疫缺陷或確診之前的新生兒和嬰兒，必須接受輻照血小板并且持續時間至少到出生后6個月;對于輸注來自1級和2級親屬的血小板均宜輻照;宮內輸血和換血時，宜選擇采集后5 d以內的血液做輻照，并在輻照后24 h內輸注;對于霍奇金氏淋巴瘤成人和兒童患者宜終生輸注輻照血小板。但指南不推薦對所有血液均進行大規模的輻照，對于造血干細胞移植患者、嚴重細胞免疫缺陷患者、胎兒和新生兒、免疫能力特別強的個體等這類特殊病人，是否必須輸注輻照血小板及輸注后的治療效果仍需高質量的數據支撐，對于某些特殊情況下患者急需輸注血小板可以不用輻照，以免錯過最佳的治療時間。

此外潛在的細菌污染是造成血小板保存期短的一個重要原因，輸注含有細菌的血小板的患者可能會發生嚴重感染，伽馬射線輻照滅活細菌受細菌類型及細菌濃度的限制，細菌濃度過高時，伽馬輻照不足以使細菌失活，而對極低濃度的細菌污染，伽馬輻照也會受到細菌性質(革蘭氏陽性及陰性)等因素的影響，目前推薦的伽馬輻照血液的劑量對不同的細菌種類、細菌濃度的滅活仍有待進一步研究。