蝦肉是一種極易腐爛的產品，然而，冷藏可以減緩腐爛。本研究采用電子束輻照(EBI)紅蝦肉進行預處理，并利用代謝組學分析方法對處理后的蝦肉在冷藏過程中的代謝產物進行分析。本研究總共鑒定出4865種代謝物，其中103種差異代謝物具有KEGG ID。此外，還獲得了兩個潛在的生物標志物。結果表明，在冷藏過程中，L-賴氨酸表達下調，而2’-脫氧鳥苷、5’-脫氧鳥苷和二羥丙酮磷酸酰酯表達上調。在冷藏過程中，L-賴氨酸表達降低，而2’-脫氧鳥苷-5’-單磷酸酯和二羥丙酮磷酸酯表達上調，代謝活性在9d后開始逐漸減弱。然而，本研究沒有鑒定與EBI相關的不同代謝物，但研究結果還是從分子水平揭示了紅蝦在EBI后冷藏過程中的代謝變化。
實驗結果
1. 代謝物的鑒定
UPLC-MS檢測到17852個峰(包括6665個負離子峰和11887個正離子峰)。此外，本研究還鑒定出4865種代謝物，包括1861種負離子型代謝物(ESI-)和3004種正離子型代謝物(ESI+)。
2. 多變量數據分析
這項研究中最重要的步驟之一是數據質量的驗證。質控樣品必須反饋可靠和高質量的結果。主成分分析結果表明，所有樣本基本上都在95%的置信區間內(圖1)，當進行成對比較時，所有累積解釋率(R2X(CUM))都高于0.6，這表明我們可以獲得反映實際樣本分布的主成分分析模型。主成分分析結果顯示，隨著冷藏時間的延長，各組之間存在明顯差異。此外，隨著天數的增加，第0天與其他天數的差異逐漸擴大。第12天和第15天的PCA結果比較接近，說明第12天和第15天的代謝物差異相對較小。因此，輻照后冷藏過程中的代謝組分具有明顯的分布規律。此外，OPLS-DA模型顯示兩組之間(x軸)有顯著差異，所有采樣點都在95%的置信區間內。OPLS-DA模型的擬合檢驗表明樣本的解釋能力(R2Y(CUM))接近1，預測能力(Q2(CUM))大于0.55。這些結果與主成分分析的結果是一致的。200次排列檢驗的斜率很大，說明OPLS-DA模型沒有超出擬合范圍。綜上所述，OPLS-DA模型具有較好的解釋和預測能力并反映了不同樣本組之間反應的真實差異。以上結果表明，在輻照后15d內，紅蝦的肌肉代謝物隨時間發生顯著變化。
A、B、C、D和E組分別代表0、6、9、12和15d
3. 差異代謝物的篩選和分類
本研究利用熱圖分析鑒定差異代謝物(圖2)。熱圖顯示，各組相交后共同上調的代謝物是2’-脫氧鳥苷-5-磷酸、八氟環丁烷和二羥丙酮磷酸酯，下調的差異代謝物是4-羥基瓜氨酸、S-蜂斗菜素、L-賴氨酸和D-吡啶甲酸。為了進一步鑒定樣品隨冷藏時間的變化而產生的不同代謝物，我們在OPLS-DA模型中篩選出VIP>1的代謝物。從最初鑒定的4865種代謝物中，我們總共鑒定出351種、337種、181種和145種差異代謝物。與第0天相比，第6天有134個差異代謝物上調，217個差異代謝物下調。與第6天相比，第9天只有39個差異代謝物上調，298個差異代謝物下調。與第9天相比，有110個差異代謝物上調，71個差異代謝物下調。與前兩組相比，第15天和第12天差異顯著的代謝物數量明顯減少(54種上調，91種下調)。大多數差異代謝物是脂質和類脂分子;有機雜環化合物;核苷、核苷酸及其類似物;苯丙烷和聚酮;苯類;有機酸及其衍生物;有機含氧化合物;以及未分類的化學品。這些結果表明，紅蝦在冷藏過程中肌肉代謝發生了明顯的變化。
A、B、C、D和E組分別代表0、6、9、12和15d
4. 差異代謝物的KEGG分類及富集分析
本研究進一步分析了不同代謝途徑的富集情況。首先，我們將在四個對照組中獲得的差異代謝物映射到KEGG數據庫中，得到46、93、41和34個具有KEGG ID的差異代謝物。隨后，我們對這些組進行KEGG途徑富集分析，以確定其代謝途徑的差異。有顯著差異(P<0.05)的代謝途徑圖分別為6、8、7和2(圖3)。A、B組差異代謝產物主要集中在嘌呤代謝、甘油磷脂代謝、組氨酸代謝、賴氨酸降解、氨基酰tRNA生物合成和精氨酸生物合成;B、C組差異代謝產物主要集中在組氨酸代謝、嘌呤代謝、氨基酰tRNA生物合成、精氨酸生物合成、ABC轉運蛋白、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸生物合成;C組和D組差異代謝物的代謝途徑主要集中在嘌呤代謝、甘油磷脂代謝、賴氨酸生物合成、ABC轉運蛋白、氨基糖和核苷酸糖代謝、組氨酸代謝和肌醇磷酸代謝;D組和E組的差異代謝物只有兩條途徑：嘧啶代謝和嘌呤代謝。
紅色和藍色虛線分別表示 P = 0.01 和 P= 0.05;A、B、C、D 和 E 組分別代表 0、6、9、12 和 15 天。
討論
保鮮一直是水產品研究的熱點問題。新陳代謝是影響蝦品質的重要因素。蝦保鮮的研究主要集中在理化過程、微生物學研究、感官指標、顯微結構和特殊處理后的揮發性代謝物等方面。然而，目前對LC-MS非靶向代謝組學的研究很少。本研究利用LC-MS技術對輻照后蝦肌肉的代謝機制進行研究。我們通過分析KEGG，選擇了以下八類來評估數據集：苯類;類脂和類脂分子;核苷、核苷酸和類似物;有機酸和衍生物;有機氮化合物;有機氧化合物;有機雜環化合物;以及苯丙烷和聚酮(表1)。苯丙烷類化合物、聚酮類化合物和有機氮化合物在這里沒有被討論，因為它們是少數幾種不同的代謝物。在冷藏過程中，L-賴氨酸表達下調，而2’-脫氧鳥苷、5’-脫氧鳥苷和二羥丙酮磷酸酰酯表達上調。脂質和類脂質分子，如CDP-甘油、PC、SM，以及核苷、核苷酸和類似物，腺苷單磷酸、ADP-D-核糖、dGTP、DTMP，在前6天發生了變化。此外，KEGG ID鑒定的所有苯丙烷類和聚酮類化合物僅在前6天發生變化。KEGG ID鑒定的變化代謝物主要分布在前9d，包括大多數脂質和類脂分子、核苷、核苷酸及其類似物、有機酸及其衍生物、有機氮化合物、有機氧化合物和有機雜環化合物。9天后，差異代謝物的變化減少，其中脂質和類脂分子的變化最為明顯。12天后，含有KEGG ID的有機氮化合物種類基本保持不變。以下各節將討論不同代謝物間的生物學相關性。
1. 與苯類化合物相關的差異代謝物
差異性苯類代謝物分別屬于氨基酸代謝、藥物代謝和ABC轉運蛋白，其中2-苯乙酰胺、3，4-二羥基苯乙酸和腺基琥珀酸是氨基酸的代謝產物。作為酪氨酸代謝的最終產物，3，4-二羥基苯乙酸在冷藏12d后顯著上調，說明酪氨酸代謝在12d時達到最大值。同時，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝的中間產物腺基琥珀酸在冷藏15d后顯著上調。這兩種苯類物質的顯著增加表明，冷藏12d后，蝦的品質發生了明顯的變化。
2. 與脂質和類脂分子相關的差異代謝物
脂肪氧化是肉類脂肪組織變質的主要原因，參與這些反應的主要因素包括脂質的結構類型及其環境，脂肪酸的不飽和度，以及光和熱暴露。此外，分子氧、促氧化劑和抗氧化劑成分的存在也是影響脂質氧化穩定性的因素。如表1所示，保鮮過程中的脂質代謝物主要為磷脂酰膽堿(PC)，隨著冷藏時間的延長，磷脂酰膽堿的含量不斷減少。PC是冷藏過程中脂質代謝的潛在生物標志物，主要存在于甘油磷脂代謝中。作為質膜的一部分，PC對新細胞的生長起著至關重要的作用。因此我們預測，這一物質的下調意味著蝦品質發生了變化。鞘磷脂(SM)是細胞膜和結構中普遍存在的一種成分，與細胞的生長、存活和死亡有關。此外，它還作為信號代謝產物控制免疫效應，如趨化、免疫細胞分化和效應細胞反應。綜上所述，我們發現輻照后的蝦在冷藏前6天內品質沒有明顯變化，6天后營養成分發生了變化。輻照紅蝦后的保鮮時間明顯長于未輻照紅蝦。
表1 利用KEGG途徑富集的差異代謝物
3. 與核苷、核苷酸和類似物相關的差異代謝物
核苷、核苷酸及其類似物主要與嘌呤代謝、嘧啶代謝、氨基糖和核苷酸代謝、甘油磷脂代謝有關。環磷酸腺苷(CAMP)是一種ATP產物，是調節細胞內物質代謝和生物功能的重要物質，是生命信息傳遞的“第二信使”。在嘌呤代謝中，cAMP上調表明蝦肉在冷藏過程中消耗能量。作為嘧啶代謝的最終產物(圖2)，DTMP在0~6d表達下調，這可能是由于生命活動減弱，導致合成減少所致。在冷藏過程中，2’-脫氧鳥苷5’-單磷酸(DGMP)含量升高，其上調機制目前尚不清楚。我們估計這是由dGTP上調引起的。根據核苷、核苷酸和類似物的變化可以看出，冷藏過程中的生命活動和能量代謝在前6d較為活躍。我們假設隨著核苷、核苷酸和類似物提供的能量減少，生命活動和能量代謝變得難以維持，導致衰變加速。
4. 與有機酸及其衍生物相關的差異代謝物
有機酸及其衍生物參與許多生物途徑的代謝過程。本文僅對必需氨基酸L-異亮氨酸和L-賴氨酸進行了討論。這三種物質所代表的降解途徑是纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和賴氨酸的降解。在冷藏過程中，L-異亮氨酸和L-賴氨酸的表達顯著降低，說明蝦肉中的營養物質流失。其他氨基酸，如L-精氨酸的下調，也證實了營養的喪失。N-2-琥珀酰谷氨酸-5-半醛是L-精氨酸和L-谷氨酸的中間產物，它的上調表明整個反應系統被加速，從而導致營養損失。有機酸及其衍生物的變化表明，蝦肉在輻照后9天的冷藏過程中變化較為復雜。9天后，由于有效營養素的減少，差異代謝物的數量可能會顯著減少。這也表明，與未輻照的蝦肉相比，輻照后的蝦肉可以顯著延長其貨架期。
5. 與有機氧化合物相關的差異代謝物
有機含氧化合物是一個復雜的體系，不同的化合物參與不同的途徑。磷酸二羥丙酮和磷酸二羥丙酮酰酯參與甘油磷脂代謝，犬尿氨酸和L-3-羥基犬尿氨酸參與色氨酸代謝，而肌醇-1-磷酸是由葡萄糖-6-磷酸通過肌醇-1-磷酸合成酶的作用而衍生出來的(從0到6天不等)。肌醇-1-磷酸的下調表明，在冷藏過程中，磷酸和氨基酸轉運蛋白的轉運速度減慢，營養物質丟失。輻照9d后，有機氧化合物含量也發生了明顯變化，說明輻照可以延長蝦的貨架期。
6. 與有機雜環化合物相關的差異代謝物
有機雜環化合物主要參與嘌呤代謝。參與該途徑的主要分子包括鳥嘌呤、次黃嘌呤、海因-5-丙酸和咪唑丙酸，其中次黃嘌呤已被確定為水產品新鮮度的潛在生物標志物。魚中的次黃嘌呤濃度隨著儲存時間的延長而增加，高水平的次黃嘌呤會導致苦味。然而我們發現在冷藏過程中，蝦中的次黃嘌呤水平被下調。次黃嘌呤是一種與炎癥和氧化應激相關的代謝標記物，它是一種可以通過提高內源性黃嘌呤氧化酶活性來改善抗菌性能的物質。它的下調可能意味著對蝦細胞抗菌性能的減弱。作為ATP的分解產物，其下調可能與ATP總量的減少有關。最近的一項研究表明，次黃嘌呤可以通過UCP2誘導肌肉ATP的消耗。
結論
在本研究中，我們研究了輻照紅蝦在冷藏過程中的代謝變化。在15天的冷藏期間，我們鑒定了4865種代謝物，其中103種具有獨特的KEGGID。差異性代謝物的主要KEGG富集途徑為嘌呤代謝、甘油磷脂代謝和組氨酸代謝(P<0.05)。我們在冷藏過程中發現了兩個潛在的生物標志物，即PC和次黃嘌呤。磷脂酰膽堿是脂質代謝的生物標志物，次黃嘌呤是水產品新鮮度的生物標志物。脂質和類脂分子、核苷、核苷酸、類似物和有機酸及其衍生物在蝦肉冷藏過程中起著重要的作用。本研究從分子角度論證了輻照可以延長蝦肉的貨架期，，從而為輻照鮮蝦提供了理論依據。
原文鏈接： https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0308814621017192
