藥物的吸收、分布、代謝和排泄(ADME)研究是新化學分子實體開發過程中最重要的研究內容之一，也是藥物注冊過程中不可缺少的關鍵部分。相對于常規生物樣本檢測技術，放射性標記示蹤技術優勢明顯，例如生物體對標記與非標記的藥物分子不做區分，兩者所表現的生物學特征是一致的，同時，放射性核素通過衰變釋放可被檢測的射線信號進行物質定量和定位，可以避免生物基質的干擾。在CFDA發布的《藥物非臨床藥代動力學研究技術指導原則》中也指出了放射性同位素示蹤技術在藥動學研究過程中的應用價值和優勢。隨著放射性標記技術的迅速發展，在藥物發現和開發階段中的應用也越來越廣泛。本文對近年來放射性同位素在藥物研發中的應用進行了梳理和總結，特別是該技術在體外、體內動力學和藥物安全性評價領域中的價值和優勢，以及放射性標記檢測新技術的應用，以期為藥物研發企業、相關領域研究人員提供新的可借鑒的參考。

1  放射性同位素示蹤劑的選擇

在放射性標記示蹤中，除了放化純度和比活度外，選擇合適的放射性核素和標記位置至關重要。常用的核素有14C、3H、125I、32P、35S等，其中14C和3H是藥動學研究中最常用的放射性核素，其特點首先是它發出的是很安全的低能β射線，易于防護并可用液閃技術測得，實驗操作及結果檢測十分方便，特別是14C;其次由于其半衰期長(5 730年)，在實驗中測得的數據結果計算時不需要作物理半衰期的矯正。14C主要應用于小分子藥物的示蹤研究，在標記位點的選擇時，一般應首先考慮對分子結構中的芳香環或脂環上的C原子進行標記，而盡可能避免在羧基、羥基、巰基、氨基等活性部位進行標記，還應遠離化學鍵斷裂位置，因為一旦這些不穩定基團脫離母體化合物，就失去了對母體藥物及主要代謝物的示蹤能力。目前在小分子化藥的放射性同位素應用實例中，14C超過80%。

3H特點與14C有些相似(發射低能β射線，半衰期12.35年)，與14C比其缺點是標記物容易與環境中的1H原子發生交換，因此穩定性較差。3H的優點是標記物的合成較為方便廉價，因此在標記物能夠滿足實驗需求的情況下，也常選用3H標記物作為示蹤劑。此外，3H不僅能用于小分子藥物ADME研究，還可以用于某些大分子藥物(如多糖)的示蹤劑。

另外主要用于蛋白/多肽類藥物研究的核素是125I，它可以用化學合成法共價結合到酪氨酸或組氨酸的側鏈上。125I發射γ射線，可以用γ計數儀檢測，由于γ射線穿透性較強，樣品檢測幾乎不受基質效應影響。另外125I半衰期較短(59.6 d)，放射性廢物存放一定時間后，待放射活度降低至環境本底水平，即可按普通廢物進行處理，相較于其他核素來說對環保的負面影響較少。

常規實驗多采用一種放射性同位素標記待測的藥物，但有時原型藥物在代謝過程中因化學鍵斷裂同時生成2個重要代謝產物，這時可采取雙標記技術的放射性示蹤劑，此時最好選用不同能量或發射不同類型射線的核素，例如14C/3H、14C/125I等。

2  放射性同位素示蹤技術在體外研究中的應用

2.1  在體外腸吸收試驗中的應用

藥物在胃腸道的吸收性可通過藥物透過胃腸道的滲透能力評價，此外腸壁細胞內側存在藥物外排泵，可以把已經攝入細胞內的藥物外排出去，從而影響藥物的吸收與藥物的生物利用度。人類結腸腺癌Caco-2 細胞系，具有與小腸上皮細胞相似的形態和功能，在透性支持物上培養可完成自動分化，形成具微絨毛以及緊密連接等類似于小腸上皮細胞刷狀緣側的分化特征的單細胞層。目前，該細胞模型結合放射性同位素示蹤技術已廣泛用于評價藥物腸道滲透能力、預測藥物口服吸收利用度及預測藥物與外排轉運蛋白的親和力等。

放射性探針藥物如14C-聚乙二醇4000、14C-甘露醇、3H-普萘洛爾等可用于細胞完整性和致密性研究，常作為Caco-2系統的模型藥物在各種文獻中提到，并被FDA推薦應用。3H-地高辛為推薦的外排型藥物轉運蛋白P-gp的標準底物，可以作為探針藥物用于Caco-2細胞中P-gp的活力驗證。總結文獻報道及國內外指導原則，結合本實驗室研究經歷，本文對Caco-2細胞模型常用的放射性工具藥及評價標準做出了歸納，可供研究者參考，見表1.因同位素探針藥物的測定相較于質譜測定操作簡易，耗時短，檢測限低，在用Caco-2細胞進行人體生物等效性豁免試驗時經常將其作為不同BCS分類的工具藥使用。3H-普萘洛爾、3H-美托洛爾、3H-米諾地爾、3H-肌酐、14C-二甲雙胍、14C-甘露醇等目前在本實驗室作為不同滲透性工具藥用于人體生物等效性豁免試驗。

2.2  在基于藥物轉運蛋白的體外研究中的應用

從藥物研發和臨床的觀點，藥物轉運蛋白研究的重要性是集有效性和安全性于一身。藥物轉運蛋白不僅直接參與藥物的吸收、分布、排泄等藥動學行為，同時與分布于靶器官的有效藥物濃度密切相關，直接影響藥效的發揮、藥物的體內清除和毒副作用的產生。因此，建立有效的藥物轉運蛋白體外篩選評價體系，提高對臨床前研發藥物的有效性和安全性評價，是加速新藥研發的有效方法。

本研究室通過基因克隆、基因重組、載體構建、細胞轉染等技術，構建了20余人源轉運蛋白穩定表達細胞系，以放射性同位素標記的不同轉運蛋白的特異性底物為探針，用液體閃爍計數儀進行測定，進行藥物與不同藥物轉運蛋白的親和性研究。現將本實驗室構建好的人源藥物轉運蛋白穩定表達細胞系及所用的放射性同位素總結于表3.供研究者參考。在細胞模型試驗中，同位素標記化合物的應用是最常見的，包括3H和14C兩種標記方式。14C標記化合物半衰期長，且結構穩定，但3H的檢測靈敏度能達到14C的1 000倍左右，因此在選擇放射性標記種類時，既要考慮標記化合物的穩定性，還要考慮與轉運體的親和性和檢測靈敏度。

2.3  在體外酶代謝中的應用

在藥物發現和早期開發階段，還沒進行人體試驗，體外代謝實驗將提供可能在人體內觀察到的代謝模式的早期信息，而放射性同位素示蹤技術在體外酶代謝中更是起著無可替代的作用。通常用肝組分(微粒體或S9)或肝細胞獲得體外代謝物譜。體外代謝物譜的經典做法是，將一種藥物與肝微粒體等孵化，然后通過放射性檢測和LC/MS/MS對孵化液進行色譜分析，以追蹤和鑒定代謝物。放射性標記藥物作為示蹤劑還可以方便地比較藥物在不同種屬的代謝情況。體外反應表型實驗中，常應用質譜法比較代謝產物和原藥的離子化程度等評估代謝產物的相對生成量，但一旦獲得放射性標記藥物，可以應用HPLC-放射性檢測法，通過比較特征放射性峰測定體外代謝表型研究中代謝產物的相對豐度，然后用特定酶在微粒體等的相對豐度對重組酶的反應速率進行換算。

2.4  在血漿蛋白結合率和血細胞分配率研究中的應用

血漿蛋白結合在測定藥物總的代謝分布中發揮著非常重要的作用。血漿中非結合的藥物很容易到達靶器官，反之結合到血漿蛋白上的藥物則很難通過毛細管壁以及穿透細胞膜。藥物進入血管外空間的能力也由藥物在血液成分(如紅細胞)中的分配特性決定。紅細胞分離和血漿蛋白結合度通常可以通過體外研究評估。測定血漿蛋白結合最可靠的方法是檢測平衡透析試驗中血漿及緩沖液內游離藥物的含量。液質聯用方法比較耗時，涉及到方法建立、方法確證和樣品制備等問題，且還存在基質干擾問題(因血漿蛋白結合實驗含有高鹽濃度的樣品溶液中會產生離子抑制等問題)。相反，若采用放射性標記化合物研究蛋白結合實驗，則可以通過液體閃爍計數儀直接測定藥物濃度。而且因其獨特的檢測特性，放射性檢測也能夠獲得更加準確的數據。

3  放射性同位素標記在藥物體內動力學研究中的應用

藥物的吸收、分布、代謝和排泄是藥物開發階段研究中重要的組成部分，通過獲得的藥動學參數，可以很好地闡明藥物在體內的動態變化規律。在生物藥劑學評價中，藥代參數可以用于評價制劑的特性和質量。而在藥效學和毒理學評價中，藥代行為可以為揭示藥物的作用機制，選擇適宜的動物種屬提供參考，特別是藥物及其相關代謝產物的體內濃度也與其藥效/毒效高度相關。因此獲取藥物動力學數據對于藥品開發評價就顯得尤為重要。

諾和諾德公司通過3H和14C標記針對其開發的新型長效凝血因子IX產品(nonacogbeta pegol, N9-GP)進行了完整的動力學特征評價。吸收動力學、組織分布、排泄數據通過單次靜脈注射給予雄性Wistar大鼠和犬標記藥物后采集樣本測定獲得。研究結果顯示原型藥物具有某種程度的兩相分布特征，血漿消除較快(半衰期1～2 d)，而總放射性檢測則顯示出明顯的兩相特征，初始分布1～2周(t1/2α：2～3 d)而后表現出較長的末端消除過程(t1/2β:15～18 d)，長半衰期也與其他PEG化的蛋白末端消除的行為一致。通過放射性表型分析發現血漿中兩種主要的放射性標記物分別是完整的N9-GP和40 kDa左右的PEG，給藥后1周左右，血漿中的主要成分是N9-GP，而隨著N9-GP的降解消除，游離的PEG的含量上升并且長期存留于血液循環中。另外，組織分布研究指出N9-GP的放射性多集中于肝和腎臟，結果與排泄研究一致，大約有44%和28%的總放射性(3H)，56%和49%的總放射性(14C)分別經尿和糞便回收。其中最強的放射性回收集中于給藥后的24 h，并且約有一半的放射性在給藥后2～3周回收。N9-GP的肝腎分布和排泄也通過放射自顯影研究得到了進一步的確證。

Lee等通過對PEG化的血紅素SB1進行125I標記示蹤研究其藥動學行為。在分別靜脈給予雄性SD大鼠(5、12.5 mL/kg)和beagle犬(10 mL/kg)放射標記的血紅素SB1后，利用伽馬計數器檢測全血和血漿中的放射信號。大鼠低劑量組給藥后血漿Cmax、t1/2、AUC和Tmax分別為9.055 mg/mL、9.6 h、79.6 mg/(h?mL)和0.2 h，全血中Cmax、t1/2、AUC和Tmax則分別為4.954 mg/mL、9.7 h、37.6 mg/(h?mL)和0.11 h。而高劑量組給藥后Cmax和Tmax呈現明顯劑量相關性，分別增加2.1和2.8倍。給予beagle犬后，血紅素t1/2顯著增加約5倍，顯示出慢消除的特點。相關研究為評估PEG化血紅素藥理特征提供了數據支持。

除應用放射性標記進行臨床前藥物動力學研究外，人體試驗中放射性標記也十分重要，GSK開發了一種口服MEK1/2選擇性抑制劑曲美替尼并在I期臨床研究中通過微量示蹤(microtracer)研究了藥物在人體內的暴露，特別是其生物利用度。先口服給予受試者2 mg未標記的曲美替尼后，再經靜脈注射給予5 μg(約7.4 kBq，200 nCi)14C標記的藥物。結果顯示曲美替尼的絕對生物利用度約72.3%，同時其血漿清除率約為3.21L/h。較高的生物利用度和較低的清除率也表明藥物的肝臟提取率較低，首關效應不明顯。另外，藥物經口服和靜脈給藥的消除半衰期為10～11 d。對于這種長半衰期的藥物，放射微量示蹤技術就體現出了明顯優勢，例如可以避免傳統交叉試驗中的較長的清洗期，因此可以讓受試者無需等待就可以接受其他藥物治療或者招募正在清洗期的病人進入新的試驗研究。

4  放射性同位素示蹤技術在物質平衡、代謝機制中的應用

在藥物臨床前開發和早期臨床研究階段，通過收集動物或受試者的排泄物(包括糞、尿和膽汁)可以進行物質平衡研究，進而獲取受試藥物的排泄途徑和排泄速率，以及進行代謝產物鑒定和藥物吸收行為估計。在物質平衡研究和代謝機制研究方面，放射性同位素標記結合傳統LC-MS法已經顯示出了明顯優勢。

基因泰克公司在研究曲妥珠單抗-Emtansin偶聯物組成中的微管抑制劑DM1的代謝過程中通過靜脈單次給藥給予了SD大鼠3H標記的DM1。研究指出放射性從血液中快速消除，并分布在主要器官。給藥5 d后，近乎100%的總放射性通過糞便進行了回收，其中膽汁排泄占據了藥物主要的排泄途徑(3d回收了46%)，而尿液排泄不足5%。另外除膽汁樣本分析提示原型藥物占比較小外，DM1的代謝產物主要通過氧化、水解、S-甲基化和結合反應生成。結果表明DM1在體消除快速，并且藥物代謝途徑廣泛，同時主要通過肝膽途徑排除體外。

Richter O等在近期針對一種口服MEK1/2高選擇性抑制劑Pimasertib進行了完整的人體藥動學研究時使用了放射性同位素標記。受試者分別接受靜脈推注2 μg(約9 kBq)和口服60 mg(約2.6 MBq)14C標記的Pimasertib。研究結果表明口服給藥后85.1%的總放射性可以在排泄物中回收，其中藥物主要通過尿(52.8%)和糞便(30.7%)排泄，另外78.9%的放射性是以代謝產物的形式存在，并且找到了兩種血漿中主要的代謝產物。

由于放射性同位素更高的靈敏度，通過給予動物或者受試者放射性標記的物質后采集排泄物樣本可以獲得比傳統生物檢測方法更好的物質平衡研究結果，結合藥動學結果可以更好地對原型藥物和代謝產物進行鑒定和定量分析。盡管通常條件下，放射性標記技術可以達到總放射性回收率85%甚至更高，但是低回收率情況也時有出現，例如樣本收集不完全，特別是對于大動物(beagle犬、猴)難以完全收集其排泄物，同時籠具清洗困難;另外放射標記位置選擇也會決定放射性回收，那些可以斷裂進入內源性代謝途徑的位點可以導致標記部位最終代謝為14CO2而從呼吸道排出，因此在選擇動物種屬和標記位點是應全面考慮，盡可能避免造成低回收的情形出現。

5  放射性同位素示蹤技術在藥物安全性評價中的應用

藥物及其代謝產物需要在開發階段進行動物和人體實驗研究其暴露程度以確保藥物相關物質的安全性。在ICH非臨床安全性評價研究指南《NonclinicalSafety Studies for the Conduct of Human Clinical Trials and MarketingAuthorization for Pharmaceuticals》中對于超過10%總暴露量的代謝產物要求進行評估，而以非放射性標記方法測定所有代謝產物的暴露量通常是不可靠的，特別是對于那些有很多代謝產物的藥物，而單劑量給予放射性標記的藥物則可以很好解決這些問題。

以利希普坦(Lixivaptan)為例，Prakash C等利用口服單次給予受試者14C標記的利希普坦后采樣進行血漿中代謝產物的表征和定量分析，與臨床前毒理研究中所得代謝產物數據進行比較發現代謝產物的差異。對于廣泛代謝的利希普坦，pyrrolocarboxylic(M5)和anthranilicacid(M6)被鑒定是利希普坦的主要代謝產物，其中anthranilic acid在人體、大鼠和犬上都被證實是主要代謝產物，而pyrrolocarboxylicacid在大鼠和犬上暴露則相對低得多。另一個吡咯烷酮代謝產物M3在大鼠和犬上被確證為主要代謝產物，而在人體試驗中M3難以與另外2個代謝產物M1和M2進行區分，M3的作用因此難以在人體上確證。除了主要代謝產物外，研究還找到了另外6個代謝產物，其中M6、7、8的暴露量均高于大鼠或犬上的含量，而M1、2、3的暴露相較于動物則低得多。另外還有其他未能指認的成分，但是總暴露量低于5%，因此與藥物的安全性相關性較弱，可不做過多關注。盡管在人體上唯一暴露的代謝產物情況比較罕見，更多的情況還是藥物的代謝產物表型種屬差異小，而暴露量存在明顯差別，因此FDA指南建議在早期藥物開發階段進行藥物代謝差異分析。另外啟動大規模臨床研究前需要明確藥物代謝產物的類型和種屬差異，因此盡可能早的進行代謝產物表征和確證就顯得十分迫切。

6  放射性標記檢測新技術

在放射性同位素檢測應用中，液體閃爍分析(liquid scintillation counting, LSC)、流動液體閃爍分析(flow scintillation analyzer, FSA)和微孔液體閃爍分析(microplatescintillation counting, MSC)通常作為在線或離線檢測器與傳統分析方法聯用進行代謝產物分析、結構確證和定量分析。而正電子發射斷層成像技術(positron emissiontomography, PET)包括PET/CT和PET/MRI作為一種高靈敏的非侵入式成像技術正在被大量應用于藥物開發的臨床和非臨床研究階段。PET通過給予受試者或者動物11C、13N、15O、18F等缺中子同位素，基于這些元素衰變同時釋放正電子的特性，并結合湮滅反應過程中產生光子強度不同的特點通過計算機處理放大進行影像重建，進而從分子水平反映組織器官病理生理、生化代謝、功能性改變或體內受體分布。PET技術除了在疾病早期篩查和診斷外(如病灶定位)，PET也可以對于藥物的在體過程進行精確定位。例如將18F標記的脫氧葡萄糖(FDG)給予受試者后通過其分布進行癌癥篩查，通常健康的甲狀腺中FDG含量很低，而異常高水平的FDG可根據其攝取方式作為慢性甲狀腺炎或腫瘤惡性程度的判定指標。另一個PET技術的成功應用則是利用11C標記的維拉帕米研究環孢霉素對P-gp底物攝取的抑制作用。作為血腦屏障中最重要的外排型轉運體，P-gp控制著很多藥物包括抗腫瘤藥物的外排過程。但是由于難以檢測，因此在體研究P-gp抑制劑的作用極為困難。Muzi等通過給予健康受試者15O標記的水分子進行血流評估，之后注射11C標記的維拉帕米進行P-gp功能評估。通過比對是否給予環孢素A的條件下11C標記的維拉帕米的動態影像數據定量，發現環孢素A對于P-gp的抑制可顯著提高腦組織中維拉帕米的含量約73%，因此通過這種非侵入方式可以方便地對P-gp介導的藥物腦組織中的暴露影響，特別是其抑制劑進行研究。盡管PET技術靈敏、分辨率高，但是相對于其他穩定同位素，PET所用同位素半衰期一般較短，11C和18F的半衰期分別只有約20min和2 h，這為制備放射標記的化合物提出了相當高的要求，同時組織分布研究也只能在較短的時間里完成。當然較短的半衰期也減少了在體研究過程中對放射劑量調整的   要求。

除PET技術外，另一種近些年來被廣泛應用的放射性同位素檢測技術是加速器質譜技術(accelerator mass spectrometry, AMS)。作為傳統放射性檢測技術的補充和替代方法，加速器質譜現在多與液相或液質聯用進行生物樣本的定量分析。AMS通過測量樣本中碳同位素的比例(14C/12C)進而對含14C標記的待測物進行定量。與依賴同位素衰變的傳統檢測技術相比，AMS極大地提高了檢測的靈敏度，相較于液閃檢測可提高至約3千萬倍。隨著檢測靈敏度的提高，含14C標記的化合物的給藥劑量也可以隨之大幅下降。除此之外，AMS檢測物質單一、不受化合物結構和基質效應的影響，也很好地彌補了傳統LC-MS檢測技術的不足。

基于技術發展，AMS現如今已經被大量應用于藥物研究，特別是藥動學領域中。微劑量給藥(通常也指0期臨床研究)可以通過給予人體常規治療劑量的1%甚至更低的水平來獲得藥物的動力學參數，例如吸收動力學、組織分布、代謝和排泄。由于給藥劑量有限，監管機構對此也準許免于在研新藥申請即可進行有限人體實驗用以采集相關數據。盡管微劑量給藥與常規劑量給藥后藥物在體過程并不完全一致，但是微劑量給藥研究所得PK數據與常規劑量給藥所得結果相關性整體上依然高達80%以上。另外在代謝產物安全性研究方面，AMS的優勢也十分明顯。通過給予受試者混有一定比例14C標記的藥物(通常約10 kBq)后檢測血漿中總放射性與原型藥物含量進行比較，可以直接判斷代謝產物的水平并決定是否后續進行代謝產物分析。通過LC-AMS聯用可以直接對原型藥物及其相關代謝產物暴露水平進行定量分析，并與臨床前研究所獲得數據進行比對來確證主要代謝產物是否有差別。

7  放射性同位素示蹤技術應用前景

現如今，放射性同位素標記示蹤技術在藥物開發中，特別是藥動學中已經得到了廣泛應用，與傳統生物檢測手段互為補充，相得益彰。除了在藥物動力學表征、組織分布、代謝/排泄機制和物質平衡等方面發揮積極作用外，放射性標記還在以下領域顯現出了不可比擬的優勢：(1)非常規代謝產物鑒定，通過對維莫德吉(Vismodegib)進行14C標記研究代謝產物，發現了吡啶環非常規開環過程;(2)藥物的蛋白共價結合(covalent protein binding,CPB)，藥物分子代謝生成活性中間體并與酶或核酸共價結合進而導致功能蛋白失活，為此默克公司開發了在體和離體CPB測試方案來評估候選藥物生物激活的可能性;(3)生物等效豁免(BE Waiver)，如果某藥物生物利用度超過90%或者90%以上藥物經由尿液排出，對于生物藥劑學III類藥物則可以判定為高滲透性。另外，新核素的標記應用和新標記方法，例如雙標法研究藥物動力學特征和組織分布也使獲取相關信息更加方便和準確。

從監管機構和制藥企業的認識角度盡管已經對應用放射性標記研究藥物特征達成共識，但是在何時、何種情況下進行放射標記的ADME研究尚存爭論。通常來講，利用體外模型進行早期代謝評估可以有效提高開發效率，進行跨種屬的代謝表型分析可以為臨床前毒理研究選擇合適動物模型提供相應依據。FDA也明確鼓勵申辦方在藥物開發階段通過多種手段獲取相關代謝數據，因而，盡早通過放射標記技術獲取所需數據可以加速藥物研發進程，縮短品種上市進程。