一項新的大規(guī)模研究表明，X射線晶體學可以用于尋找可以重新用于靶向SARS-CoV-2主要蛋白酶的藥物。除了鑒定出37種潛在的候選藥物外，這項于4月2日在《科學》雜志上發(fā)表的研究還揭示了SARS-CoV-2主要蛋白酶上可以與藥物結(jié)合的新結(jié)合位點。
SARS-CoV-2多蛋白的蛋白水解切割主要由主要蛋白酶完成。該酶包含一個胰凝乳蛋白酶樣折疊，并帶有一個C末端螺旋結(jié)構域，并且在其活性位點包含一個由Cys145和His41組成的催化二聚體，該二聚體由四個主要口袋組成。活性位點位于單體三結(jié)構域結(jié)構的兩個N-末端結(jié)構域之間的縫隙中，而C-末端螺旋結(jié)構域參與酶的調(diào)節(jié)和二聚化。
主要蛋白酶是抗病毒藥物發(fā)現(xiàn)和化合物篩選的靶標，因為它參與了病毒復制。在這項新研究中，來自德國國家電子研究中心(DESY)的研究人員試圖確定可能對主要蛋白酶有效的重新用途的候選藥物，該研究中心運行用于結(jié)構生物學實驗的粒子加速器。
DESY團隊對兩個藥物庫進行了高通量X射線晶體學篩選，以發(fā)現(xiàn)可用于抗SARS-CoV-2主要蛋白酶的候選藥物。使用PETRA III(DESY的高亮度X射線光源設備)上的P11高通量結(jié)晶學線，以原子分辨率對與藥物庫中化合物混合的主要蛋白酶的共晶體成像。
總共從弗勞恩霍夫轉(zhuǎn)化醫(yī)學與藥理學研究所的弗勞恩霍夫IME重用集合和意大利公司DompéFarmaceutici的“人中安全”文庫中篩選了5,953種獨特的化合物。與許多晶體學片段篩選實驗相反，這些藥物庫包含完整的化學復雜化合物。該化合物已經(jīng)在臨床試驗中測試了生物活性和細胞通透性。
PETRA III工作站P11包括使用機械臂進行的全自動樣品更換，因此7,000多次測量中的每一次僅花費了大約三分鐘。使用這種高通量技術，該團隊能夠迅速將目標化合物與無潛在活性的化合物分離。
測量站P11處的樣品架(左)在來自PETRA III加速器的X射線光下旋轉(zhuǎn)樣品。同時，一股冷氮氣流冷卻了樣品。借助許多來自不同方向的散射圖像，可以計算出蛋白質(zhì)-藥物復合物的分子結(jié)構。圖片由DESY / C / Schmid提供。
研究人員從X射線衍射數(shù)據(jù)集中獲得了2,381種獨特的化合物，然后對其進行了自動結(jié)構細化，聚類分析和泛數(shù)據(jù)集密度分析(PanDDA)。他們從3D蛋白質(zhì)結(jié)構中鑒定出與主要蛋白酶結(jié)合的37種化合物。
“與其他篩查方法相比，我們的X射線篩查方法的特別優(yōu)勢在于，我們可以獲得蛋白質(zhì)-藥物復合物的三維結(jié)構，因此可以從原子上鑒定藥物與蛋白質(zhì)的結(jié)合級”，DESY博士后研究員Patrick Reinke博士解釋說。“即使兩個最有前途的候選者都沒有進入臨床試驗，與主要蛋白酶結(jié)合的37種物質(zhì)也構成了基于它們的有價值的數(shù)據(jù)庫，用于藥物開發(fā)。”
大多數(shù)化合物都結(jié)合在主要蛋白酶的活性位點上。八個在活性位點內(nèi)共價結(jié)合，另外八個在活性位點內(nèi)非共價結(jié)合。十三種化合物在各個位置的活性位點外部結(jié)合。
為了進一步探索化合物的適用性，進行了基于細胞的病毒還原試驗以評估抗病毒活性。研究人員確定了總共7種化合物-一種擬肽化合物和6種非肽化合物-表現(xiàn)出至少100倍的病毒顆粒減少，且具有良好的選擇性指數(shù)(該比率可衡量細胞毒性和抗病毒活性之間的窗口)。七個化合物是AT7519，鈣蛋白酶，伊芬地爾，MUT056399，培利替尼，托哌酮和三縮水甘油基異氰脲酸酯。
第一作者和DESY博士后研究員SebastianGünther博士解釋說：“活性物質(zhì)Calpeptin和Pelitinib顯然顯示出最高的抗病毒活性，并且具有良好的細胞相容性。因此，我們的合作伙伴已經(jīng)開始對這兩種物質(zhì)進行臨床前研究。”
意外的啟示
在對全部藥物化合物進行分析的過程中，研究人員發(fā)現(xiàn)了一些出乎意料的東西-主要蛋白酶上的結(jié)合位點，這是完全未知的。在C端二聚結(jié)構域的疏水口袋中發(fā)現(xiàn)了此變構位點，該位置靠近穗蛋白的S1結(jié)合位點。該小組的篩選和基于細胞的試驗表明，pelitinib通過在該位點結(jié)合具有抗病毒抑制的潛力。此外，在所有人類冠狀病毒主要蛋白酶中，該結(jié)合位點中殘基的疏水性均是保守的。
“我們能夠在主要蛋白酶上發(fā)現(xiàn)一個新的藥物結(jié)合位點，這不僅是一個令人驚訝的驚喜，這一結(jié)果實際上只能在像PETRA III這樣的同步加速器光源下才能實現(xiàn)，而且，即使是兩者之一有希望的候選藥物正好與該位點結(jié)合。”漢堡大學的合著者克里斯蒂安·貝澤爾(Christian Betzel)博士說。
他們還確定了第二個變構位點，該位點是由催化結(jié)構域和二聚化結(jié)構域之間的深槽形成的。雖然AT7519是篩選物中唯一與該位點結(jié)合的化合物，但活性中等，但科學家認為，該位點可能是通過調(diào)節(jié)Arg298(一個對酶二聚化至關重要的殘基)而成為的新靶標。
DESY理事會主席Helmut Dosch博士強調(diào)：“ PETRA III的調(diào)查令人印象深刻，顯示了高亮度同步加速器光源與未來藥物的開發(fā)以及整個健康研究的相關性。” “我們必須并且希望將來進一步擴展我們的基礎設施，以應對當前的健康危機。”
